电针结合运动疗法对急性脊髓损伤大鼠Cdc42因子表达的研究*

*基金项目: 国家自然科学基金项目(81102644)；浙江省自然科学基金项目(Y2100533)；国家中医药管理局中医药重点学科(针灸学)建设项目(国中医药发[2009]30号)；浙江省“重中之重”学科(针灸推拿学)建设项目(浙教高科[2008]255号)。

电针结合运动疗法对急性脊髓损伤大鼠Cdc42因子表达的研究*

*基金项目: 国家自然科学基金项目(81102644)；浙江省自然科学基金项目(Y2100533)；国家中医药管理局中医药重点学科(针灸学)建设项目(国中医药发[2009]30号)；浙江省“重中之重”学科(针灸推拿学)建设项目(浙教高科[2008]255号)。

★张柳娟1何克林1马睿杰1,2**(1.浙江中医药大学第三临床医学院杭州 310053；2.浙江中医药大学附属第三医院杭州 310053)

摘要：目的：本实验通过检测脊髓损伤后Cdc42的蛋白表达来探讨电针结合减重步行训练疗(BWSTT)法的治疗机制。方法：选用健康成年雄性SD大鼠90只，随机分为假手术对照组(A组)、模型对照组(B组)、夹脊电针观察组(C组)、夹脊电针结合减重步行训练观察组(D组)、药物组(E组)。急性脊髓损伤(SCI)模型采用美国NYU脊椎冲击损伤仪致大鼠T9-T10段脊髓急性中度损伤。采用免疫印迹和免疫组化技术检测各时间点损伤段脊髓Cdc42的表达。结果：在两项检测技术中，假手术对照组的蛋白表达一直处于稳定低水平状态。SCI术后表达呈逐渐增加的趋势,28d时达到高峰，两组观察组及药物组与模型组相比在7d、14d、28d均有显著性差异(P<0.05)，两组观察组之间在28d时具有显著性差异(P<0.05)。结论：电针结合BWSTT疗法可能通过增加Rho/ROCK激酶信号通路中下游因子Cdc42的表达，促进大鼠运动功能的恢复；从损伤后长久的复健来看，电针结合BWSTT疗法对SCI后运动功能的恢复上优于电针观察组。

关键词：电针；运动疗法；脊髓损伤；Cdc42

脊髓损伤发生率随着汽车产业的迅猛发展呈现逐年增高的趋势，而脊髓一旦损伤往往导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍，给患者、家属、社会带来了极大的负担。脊髓损伤与中枢神经具有密切关系。据报道，抑制因子的存在以及促进性环境的缺失是阻碍中枢神经再生的众多因素之一。并发现髓磷脂相关抑制因子Nogo、MAG、OMgp( Oligdendrocyte-associated myelin glycoprotein)具有激活Rho/Rock激酶信号通路的作用。有研究发现电针作用于脊髓损伤后的大鼠能抑制这些因子表达，而运用Rho抑制剂如盐酸法舒地尔可以通过竞争性拮抗作用抑制该通路[1]，从而促进轴突再生[2-3]。课题组的前期研究已证实夹脊电针对脊髓损伤后的大鼠在行为学以及与神经再生功能相关的蛋白表达中具有良性干预作用[4-5]。本研究欲从Rho/ROCK激酶信号通路入手，观察电针结合运动疗法对该通路上的Cdc42的蛋白表达影响。

1材料与方法

1.1实验动物与分组健康成年雄性SD大鼠90只，购于中国科学院上海实验动物中心，体重180～200g。实验前适应性饲养一周，采用SPSS软件产生随机数字给予染色标记编号，将其随机分为假手术对照组(A组)，造模后再将其余大鼠随机分组为模型对照组(B组)、夹脊电针观察组(C组)和夹脊电针结合BWSTT观察组(D组)、药物组(E组)。每组在7d、14d、28d三个时间点各取6只。

1.2实验主要试剂与仪器Cdc42一抗(abcam，1∶1000)；SP-9001免疫组化试剂盒(博海生物工程有限公司)；DAB显色试剂盒(中杉金桥)；盐酸法舒地尔(天津红日药业股份有限公司)；佗牌0.5寸无菌针灸针(0.30mm×13mm)；韩氏(HANS)电针仪(HANS-100)；NYU脊椎冲击损伤仪(美国，NYU-2)。

1.3脊髓损伤模型的制备腹腔注射10%水合氯醛(3.5mL/kg)进行麻醉，背部暴露T9-T10段脊髓，运用NYU脊椎冲击损伤仪以5cm/10g的势能撞击暴露段脊髓，造成该区域急性中度脊髓损伤，然后冲洗伤口后逐层缝合。假手术对照组仅切除椎板。三个征象出现其中两个即为造模成功：①身体痉挛性颤动；②尾巴痉挛性摇动；③硬脊膜内充血或血肿。术后腹腔注射青霉素抗感染，按摩膀胱帮助排尿。

各组大鼠造模后分别进行BBB评分，2分以上剔除并进行动物实验的增补。术后分别在7d、14d、28d各时间点记录BBB评分以观察运动功能恢复状况后处死取损伤节段脊髓进行检测。

1.4治疗方法模型对照组：给予腹腔注射生理盐水(量同药物组注射的药物)，每日一次；电针组：于造模成功后给予夹脊电针治疗。在损伤椎体的棘突旁开距后正中线3～4mm处取穴，垂直进针约3～4mm，针尖触及椎板，将HANS-100的导线正负极夹在同侧的毫针针柄上，频率2/100Hz[6]，电流1mA，20min/日；电针结合运动组：在夹脊电针治疗的基础上，术后第七天时进行减重步行法康复训练。训练装置以大鼠跑步机为运动平板，然后将一根带夹子的短铁丝夹住大鼠的项背部皮肤，再用一根带夹子的可调节长度的铜线夹住大鼠背侧靠近尾部的皮肤，训练平板的速度为8m/min，减重量为大鼠体重的70%、60%、30%，分别维持一星期。训练时间为每日2次，每次5min。

1.5检测方法

1.5.1Western blot 检测取出标本，提取蛋白，制作标准曲线，测定标本的蛋白浓度，以总蛋白量为30ug计算上样体积。一抗浓度(Cdc42 1∶1000，内参β-actin 1∶1000)，4℃孵育过夜，二抗以1:5000溶于T-TBS，室温孵育1h。暗盒中放上X-ray fiLm曝光5～10min后进行显影和定影，采用ImageJ软件分析蛋白相对表达量(蛋白相对表达量=蛋白表达量/内参β-actin表达量)。

1.5.2 免疫组化检测样本通过多聚甲醛固定后保存于-80℃冰箱，OCT制作冻头，切片厚度为14微米，贴片法，每张片5个样本，切五取一。37℃复温后PBS洗去OCT，3%双氧水浸泡15min，封闭1h，一抗4℃孵育过夜，浓度(Cdc42 1∶1000)。二抗37℃孵育1h，辣根过氧化物酶浸泡15min，DAB试剂盒显色，苏木素复染，脱水后封片。光镜下观察阳性细胞。

2结果

2.1免疫印迹法结果所示，Cdc42各个时间点的表达量在假手术组中保持在较低水平，在模型组中表达增多。电针组、药物组、电针结合运动组在7、14、28d时Cdc42的表达均比模型组有不同程度的增加，差异均具有显著性。在电针结合运动组中，Cdc42的表达量在28d有明显升高，与电针组相比具有显著性差异，差异具有统计学意义(P<0.05)。(见表1、图1)

组别7d14d28d假手术组0.10±0.040.09±0.030.12±0.08模型组0.36±0.070.44±0.120.62±0.18电针组0.78±0.03*1.10±0.28*1.54±0.32*FasudiL组1.06±0.25*1.64±0.0*#1.95±0.25*#电针+运动0.81±0.10*1.19±0.24*▲2.06±0.24*#

注：与模型组相比，*P<0.05；与电针组相比，#P<0.05；与药物组相比，▲P<0.05。

加的趋势，说明神经损伤具有一定的自愈性。观察组与模型组相比在3个时间点均有差异，差异有统计学意义(P<0.05)。电针结合运动组与单纯电针组相比仅在7d时差异不明显，其余两个时间点的差异均具有统计学意义(P<0.05)。电针结合运动组与药物组相比，仅在7d时差异较明显，有统计学意义(P<0.05)，在14d和28d时，药物组虽然计数较电针结合运动组多，但是差异不大，且差距随着时间减少。因此从长期的康复来说，电针结合运动该治疗方案甚至会优于药物治疗。

组别7d14d28d假手术组7.17±2.567.00±1.418.00±2.28模型组13.33±3.1418.00±1.4120.67±3.01电针组19.50±1.87*23.50±4.13*33.83±5.12*药物组26.50±4.28*#33.83±5.12*#37.83±6.11*#电针+运动19.17±2.48*﹡▲31.67±2.80*#36.50±4.51*#

注：与模型组相比，*P<0.05；与电针组相比，#P<0.05 ；与药物组相比，▲P<0.05。

3讨论

3.1Rho/ROCK激酶信号通路Rho/ROCK是组织中普遍存在的一条参与细胞的收缩、黏附、迁移、增殖、细胞骨架的形成等生理功能的信号通路[7-8]，其关键分子包括Rho GTP酶，Rho激酶(Rho associated kinase ROCK)及其作用底物。髓鞘相关抑制因子(Nogo、MAG、OMgp等)激活Rho蛋白，从而启动该信号通路。Rho/ROCK被激活后，影响肌动肌球蛋白的聚合而阻碍轴突再生[9-10]。因此抑制Rho/ROCk的信号传导通路可能成为促进轴突再生的一种途径。

图1　7天，14天组WB条带

图2　28天组WB条带

图3免疫组化组图A：假手术组；B：模型组；C：电针组；D：药物组；E：电针结合运动组。图中茶色即为阳性细胞。

3.2Cdc42细胞分裂周期蛋白(cell division cycle)Cdc42是Rho GTPase蛋白家族的成员之一[11]。该家族蛋白具有重组细胞骨架、调控基因转录和转导细胞信号等生理功能[12-13]。Luo等[14-15]在果蝇以及神经母细胞系上进行实验中证实Cdc42具有促进神经细胞迁移及轴突树突的生长作用。研究表明RhoA和RacL、Cdc42在树突棘延伸上存在着相互拮抗的作用，RhoA可以抑制树突棘的延伸和生长，而RacL、Cdc42促进树突棘的生长和延伸，而在Rho/ROCK激酶信号通路激活途径中，RhoA与激活该通路存在正相关[16]。因此，Cdc42可能具有抑制该信号通路，从而起到促进轴突再生的作用。本课题组也证实单纯夹脊电针以及电针结合运动疗法能够促进Cdc42的蛋白表达，这可能与该治疗方法作用于此通路相关。

3.3减重步行训练(body weight support treadmill training, BWSTT)减重步行训练是由Barbeau等[17]于1987年在前人的理论基础上设计的运用于截瘫患者康复治疗的训练方法。它由一个速度可控的电动跑台以及上方可以对患者进行减重的轮滑吊带组成。这一装置不断改良，有学者通过实验证实在超微环境下，BWSTT能够促进神经再生修复[18]。

BWSTT主要针对颅脑损伤、脊髓损伤等引起的下肢运动功能异常的患者，现已广泛应用于临床康复治疗。李华等[14]将42例不完全脊髓损伤患者随机分为BWSTT组与对照组，患者均接受常规截瘫康复治疗，BWSTT组在此基础上，每日加减重步行训练1次，治疗1个月后，患者的步长、步速和功能性步行分级较治疗前有明显改善，且与对照组之间相比具有显著性差异。李惠兰等[15]通过动物实验研究发现督脉电针与减重步行训练在促进横断性脊髓损伤大鼠的运动功能恢复以及NGF、GAP-43的蛋白表达中效果显著，且督脉电针优于BWSTT。

以上学者从不同的角度证明减重步行训练对于脊髓损伤(包括横断性以及不完全)的后期康复意义深重，而本课题组通过实验得出脊髓损伤大鼠在电针与减重步行训练相结合的治疗作用下，效果更是优于单纯电针，这一发现为脊髓损伤患者的临床康复治疗提供了新的思路。

参考文献

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Effects of EA and BWSTT on The Expression of Cdc42 in SCI Model Rats

ZHANG Liu-juan1, HE Ke-lin1, MA Rui-jie1,2

1.TheThirdClinicalMedicalCollegeofZhejiangChineseMedicineUniversity,Hangzhou310053,China;

2.TheThirdAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicineUniversity,Hangzhou310053,China.

Abstract:Objective: To investigate the electric-acupunture(EA) combined with BWSTT by evaluating the expression of Cdc42. Method: 90 adult maLe SD rats were randomized into the sham group (A group), the model group (B group), Jia-Ji EA group (C group) ，EA with BWSTT group (D group) and Fausidil group(E group). Spinal cords injury was made by NYU impactor on T9-T10 spinal segment. Immunohistochemical techniques detect the expression of Cdc42 in lesion segment at each time points.Results: Cdc42 expression stayed a low-level in the sham group. Expression after SCI was gradually increased, and reached a peak at 28d. The two treatment groups and drug group compared with the model group had a significant differences at 7d, 14d, 28d (P<0.05). The difference between the two treatment groups was significant at 28d (P<0.05). Conclusions: EA and BWSTT therapy may be increase the expression of Cdc42 to promote the recovery of motor function in rats by Rho / ROCK signaLing pathway. For the long-term rehabilitation after SCI, the EA combined with BWSTT superior than EA group on the recovery of motor function after SCI.

Key words:EA;BWSTT; SCI;Cdc42

收稿日期：(2015-03-28)编辑：翟兴英

中图分类号：R285.5

文献标识码：B

通信作者：**马睿杰(1978—)，女，副主任中医师，副教授。研究方向：针灸治疗神经系统疾病。E-mail：maria7878@sina.com。