AQP1基因沉默对前列腺癌PC-3细胞的影响①

牛文斌,罗振国,程 亮,王春玲

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

AQP1基因沉默对前列腺癌PC-3细胞的影响①

牛文斌,罗振国,程 亮,王春玲

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：探讨水通道蛋白1(AQP1)基因沉默对在前列腺癌PC-3细胞的作用.方法：培养PC-3细胞至对数生长期，随机分为质粒转染组和质粒空白组。针对AQP1基因设计合成小片段RNA，并构建高效表达载体。利用转染试剂LipofectamineTM2000用脂质体介导的基因转染技术将质粒转染入PC-3细胞。RT-PCR检测PC-3细胞AQP1mRNA的表达情况及激光共聚焦观察室观察、拍照AQP1表达的情况，转染后72h。将鼠龄为6周的60只BALB/C-nu/nu雄裸鼠随机分成两组，其中正常对照组30只，转染组30只。转染组把转染后的前列腺癌PC-3细胞注射裸鼠腋窝处皮下；对照组把未经转染的前列腺癌PC-3细胞注射到裸鼠腋窝处皮下。每日观察肿瘤生长及体重情况，裸鼠饲养6周处死，完整取出移植瘤瘤体测量体积和重量。结果：与质粒空白组相比，转染组应用RNA干扰技术后AQP-1在前列腺癌PC-3细胞系中mRNA的水平降低，与对照组相比，转染组裸鼠移植瘤体积为(573．39±175．24)mm3明显小于对照组(1482．50±327．86)mm3，P<0．05。转染组肿瘤重量为(0．55±0．11)g明显小于对照组(1．31±0．29)g，差别具有统计学意义(P<0．05)。结论：AQP-1广泛的表达在正常前列腺组织和前列腺癌组织中，对内环境稳态起着重要的作用。更多的AQP-1促进了前列腺癌细胞的增长，抑制AQP-1的表达可以使前列腺癌移植瘤生长减慢，体积减小。

水通道蛋白1(AQP1);前列腺癌

居欧美国家第一位的前列腺癌有明显的地区差异性和种族差异性[1]。在我国，近年因为老龄人口增多，同时各种先进仪器设备的大量出现及诊断前列腺癌的方法不断改进，前列腺癌的发病率不断增高[2]。在一些肿瘤细胞和肿瘤组织的血管内皮细胞中，水通道蛋白1(AQP-1)通过增加对水的通透性运输，促进了肿瘤的生长及向周围基质浸润[3]。以往的研究表明AQP1在前列腺癌组织中高表达[4]，为了研究和了解AQP1对前列腺癌细胞和实体瘤的影响，我们应用RNAi干扰技术和裸鼠前列腺癌移植瘤模型，观察了AQP1的高表达对前列腺癌PC-3细胞和移植瘤组织的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

人前列腺癌PC-3细胞株(ATCC细胞系)购自中国科学院细胞库。实验所用裸鼠品系为60只周龄6周体重均匀的BALB/C-nu/nu裸鼠，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养于佳木斯大学动物实验中心的小鼠饲养隔离器内。

1.2 前列腺癌PC-3细胞AQP1免疫组化检测

人前列腺癌PC-3细胞按上海中科院细胞库推荐的培养条件，使用含10%胎牛血清的F12培养液，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，每日在倒置显微镜下观察细胞贴壁情况和细胞生长状态等。待细胞融合度约70%时，吸出培养液。加入0.01MPBS( 以下所用的PBS相同)2mL，作用5min后吸出弃掉，重复洗片3次。之后加4%多聚甲醛1mL固定30min。再次用PBS洗3次，每次5min。弃掉PBS后加入1%BSA封闭液进行封闭，室温下作用30min后弃掉BSA封闭液，不用PBS清洗。每块六孔板中3个孔加入200μL一抗(兔多克隆抗AQP1一抗，1：100倍稀释)，另外3个孔对照组加等量抗体稀释液，不加兔多克隆抗AQP1一抗。做好标记，4℃过夜(或37℃孵育2h)。加一抗后的细胞及对照组细胞4℃过夜(或37℃孵育2h)后在室温放置2h，0.01MPBS洗片3次，每次5min，避光条件下加入荧光(FITC)标记羊抗兔IgG(荧光二抗, 1：50倍稀释)，在室温避光条件下放置2h后用0.01MPBS洗片3次，每次5min。做好以上步骤后，将板子里放点PBS，保存片子湿润，不要干片，以免影响细胞形态。到激光共聚焦观察室后，再将爬片取出，在干净的载玻片上滴一滴50%的甘油，然后将爬片取出来倒扣在滴过甘油的载玻片上，显微镜下观察、拍照。

1.3 RT-PCR 检测 AQP1mRNA的表达

从前列腺癌PC3细胞系中提取总RNA, 应用紫外分光光度计测定总RNA纯度同时要计算其浓度，使用RT试剂盒逆转录合成cDNA。根据AQP1在GenBank中的cDNA全长序列，使用PrimerPremier6.0软件设计引物，引物由上海生工生物工程公司合成。进入半定量PCR反应体系,AQP1引物序列：上游:5′-GAAATCCCAACTCCAAAGAG-3′ ; 下游:5′-CAGCTAGACAATGATTTGGC-3 ′ , 扩增长度为251bp;人β-actin引物: 上游: 5′-AGCGCAAGTACTCCGTGTG-3′ ;下游: 5′-AAGCAATGCTATCACCTCCC-3′,扩增长度501bp;PCR反应条件:95℃ 30s, 55℃ 30s,72℃ 40s, 扩增30个循环。上下游引物分别用适量灭菌双蒸水溶解至浓度为10pmol/μL。PCR反应体系为cDNA模板1μL、AQP1上下游引物各0.5μL、人β-actin上下游引物各0.2μL。PCR产物在 2%琼脂糖凝胶上电泳分析。

1.4 siRNA载体构建及转染

重组质粒构建后经DNA测序证实重组质粒的序列与所设计序列完全一致，表明针对AQP1基因的siRNA表达载体构建成功。应用脂质体将构建好的CTD468-18超纯质粒成功转染前列腺癌PC-3细胞，转染的效率达到40%。采用Westernblot检测AQP1蛋白在2组细胞中的表达，结果发现在位于28kD蛋白条带位置2组细胞均呈现出AQP1特异性蛋白杂交条带的表达，但亮度有明显差异，转染组细胞的蛋白条带亮度明显低于空白对照组。

1.5 裸鼠的饲养及肿瘤细胞的种植

裸鼠饲养于佳木斯大学动物实验中心的小鼠饲养隔离器内,每日给予水、食物及12h阳光，观察小鼠的生长状况。取转染72h的前列腺癌细胞及正常培养的前列腺癌细胞，在离心管中加适当胰酶消化后离心(1,000rpm，5min)，离心后去除培养液，检测存活率90%以上后方可用于接种动物。用PBS将培养细胞调至密度4×107/mL，混匀的细胞悬液放入无菌Eppendorf管，并用封口胶密封，置入冰盒待用。为了保证各组细胞活力，收集好的细胞最好在 30min内接种。6周龄雄性裸鼠60只，随机分为两组，每组30只，碘伏溶液消毒腋下穿刺点两次。上下颠倒Eppendorf管以混匀细胞悬液，用注射器吸取细胞悬液。分别接种前列腺癌细胞及转染后的前列腺癌细胞。接种后，每天观察裸鼠及肿瘤生长情况，42d后处死裸鼠，消毒手术小心完整剥离出皮下移植瘤。

1.6 统计学方法

采用SPSS18．0，数据以均数±标准差表示。两组数据之间比较用t检验, 多组均数间的显著性检验使用方差分析,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AQP1在PC-3细胞的表达

激光共聚焦显微镜显示AQP1在前列腺癌细胞表达，细胞膜及胞浆表现为绿色荧光，细胞核未着色，并且细胞形态各异，见图1。转染24h后荧光显微镜观察：在荧光显微镜下，用紫外光激发，观察到转染细胞呈红色荧光，未转染的细胞不显色，见图2。

2.2 AQP1的RT-PCR产物的表达

经2%琼脂糖凝胶电泳后，紫外透射仪下在300bp左右可见明显的特异产物带。表明AQP1正常表达。同对照组相比转染组表达减弱有统计学意义(P<0.05)，见表1。

图1AQP1在前列腺癌PC-3细胞中表达×200

图2 荧光显微镜下siRNA转染的PC-3细胞×200

表1 AQP1 mRNA (PCR产物相对量)的表达(n=10)

注: 与对照组比较P<0.05。

2.3 Western blot检测转染后PC-3细胞中AQP1蛋白的表达

细胞中AQP1蛋白的表达采用Westernblot方法检测，结果显示在位于28kD蛋白条带位置均表现AQP1特异性蛋白杂交条带的表达，但亮度有明显差异，其中转染组细胞的蛋白条带亮度明显低于空白对照组(图3)。

图3WesternblotAQP1蛋白正常前列腺癌PC-3细胞及转染后的细胞表达。(1蛋白Maker,2正常前列腺癌PC-3细胞，3转染后前列腺癌PC-3细胞)

2.4 检测裸鼠皮下移植肿瘤生长，本实验中,两组裸鼠生命活动正常, 无一死亡(图4～6)。与对照组相比，转染组裸鼠移植瘤体积为(373．39±175．24)mm3明显小于对照组(882．50±327．86)mm3，P<0．05。CMTM5组肿瘤重量为(0．55±0．11)g明显小于对照组(1．31±0．29)g，差别具有统计学意义(P<0．05)。

图4 皮下种植前列腺癌细胞 图5 皮下成瘤的裸鼠 图6 取出肿瘤组织

3 讨论

AQPs是家族性膜通道蛋白，能够快速的介导水和一些小分子物质通过。AQPs广泛分布于机体的组织和器官，不同的组织和器官有不同的AQP分布，有时是多种AQP分布于同一器官，有利于维护组织器官的生理功能[5]。AQPs除了生理情况下调节微环境维护器官的生理功能外，病理情况下特别是在肿瘤的发生发展机制中起了重要的作用[6]，AQPs在前列腺癌中的分布和作用的初步研究表明AQP1在前列腺癌组织中高表达，抑制AQP1的表达可以抑制PC-3细胞的迁移[7]。AQP1大量表达于肿瘤细胞膜或许能够改变肿瘤上皮内的渗透压，有助于肿瘤细胞体积及外形的改变，向周围基质浸润[9]。前期试验表明[8,4]与前列腺增生组织相比,AQP1高表达于前列腺癌组织中的肿瘤血管内皮细胞和前列腺癌细胞的胞浆内及胞膜上，AQP1在组织中的高表达可以改变前列腺癌细胞和周围环境渗透压的变化进一步促进细胞的迁移和增殖。但是AQP1在前列腺癌PC-3细胞中的不同水平表达情况及对前列腺癌PC-3细胞的影响还不清楚。

在本次实验中运用免疫组化和RT-PCR在不同水平检测了前列腺癌PC-3细胞中AQP1的表达，在激光共聚焦显微镜下观察、拍照，可见前列腺癌细胞薄膜及胞浆被染成绿色，胞核未着色，证实AQP1主要表达于前列腺癌细胞膜和胞浆。

RNA干扰(RNAi)是通过双链RNA分子介导的、同源mRNA高效特异性降解使相关基因表达减少或不表达的过程，属于转录后水平的基因沉默[10]。因为RNAi具有很高的特异性和高效率的特点，我们以AQP1基因为靶基因，应用RNA干扰技术沉默AQP1基因，观察AQP1基因沉默后其在前列腺癌细胞中的表达变化情况和对前列腺癌细胞生物学行为的影响，探讨AQP1基因沉默对前列腺癌细胞的抗肿瘤作用，对研究前列腺癌的基因治疗具有重要意义。本实验针对AQP1mRAN序列设计合成siRNA,并成功构建了重组质粒，用阳离子脂质体转染法将重组质粒导入前列腺癌PC-3细胞，应用Westernblot检测AQP1蛋白表达情况，结果显示：转染组细胞的AQP1蛋白表达量显著低于正常对照组，实验结果表明RNAi质粒载体的导入明显抑制了前列腺癌PC-3细胞的AQP1蛋白表达，差异有显著性(P<0.05)。为了进步了解AQP1基因沉默对前列腺癌细胞移植瘤的影响以及影响机制，我们分别建立了AQP1基因沉默组和对照组的裸鼠移植瘤模型。实验结果表明：AQP1基因沉默组裸鼠的移植瘤生长速度及体积明显小于对照组，表明干扰AQP1的表达能够抑制肿瘤的发生发展。

总之：我们检测了前列腺癌PC-3细胞不同水平的AQP1表达情况，构建和应用RNA干扰(RNAi)干扰技术进步明确了AQP1对PC-3细胞的影响。PC-3细胞的裸鼠移植瘤模型表明AQP1表达高表达促进了肿瘤的发生发展，阻断或者抑制AQP1的表达能够抑制移植瘤的发展，靶向抑制AQP1可能为前列腺癌的基因治疗提供依据。

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黑龙江省卫生厅科研课题，编号：2009-328。

牛文斌(1972～)男，黑龙江佳木斯人，博士，副主任医师，硕士研究生导师，主要从事泌尿外科肿瘤研究。

王春玲(1975～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，副主任医师。E-mail:andylau1975@163.com。

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1008-0104(2015)04-0141-03

2015-03-18)