水飞蓟茎叶中具有抗氧化活性的黄酮类化学成分研究①

陈效忠，常 鑫，吕红梅，张 艳

(1.黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.呼和浩特市卫生学校，内蒙古 呼和浩特 010050)

水飞蓟茎叶中具有抗氧化活性的黄酮类化学成分研究①

陈效忠1，常 鑫2，吕红梅1，张 艳1

(1.黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.呼和浩特市卫生学校，内蒙古 呼和浩特 010050)

目的：通过已经建立并且行之有效的化学筛选(LC-MSn)和活性筛选集成系统获取水飞蓟茎叶中具有抗氧化活性的黄酮类化合物。方法：95%乙醇提取药材获得总提取物，D101型大孔树脂富集总黄酮类化合物，多种色谱方法(sephadex-LH20, HPLC等)相结合分离得到目标化合物，NMR谱鉴定化合物结构；采用Fe2+半胱氨酸诱导的肝微粒体脂质过氧化模型进行化合物抗氧化活性筛选。结果：从水飞蓟茎叶中首次分离得到5个黄酮类化合物，这5个化合物均具有较强的抗氧化活性，IC50值 8.5～11.2。结论：从水飞蓟茎叶中获取的黄酮类化合物具有较强的抗氧化活性，我们将进一步研究抗氧化活性与临床治疗相关疾病的关系。

水飞蓟；黄酮；抗氧化

水飞蓟(Silybum marianumL.Gaertn)是菊科水飞蓟属植物，原产南欧、北非[1]。我国在20世纪50年代初引种了水飞蓟用于观赏花卉。20世纪60年代末以H. Wagner为代表的德国药学家对其有效成分进行提取后，我国才将它作为一种保肝药用植物推广种植。该植物主要在黑龙江、陕西、甘肃、河北等省栽培。水飞蓟有效成分在果实内，水飞蓟的干燥果实经提取、精制而得到的有效成分称为水飞蓟素(Silymarin)，主要包括水飞蓟宾(silybin)、异水飞蓟宾(isosilybin)、水飞蓟宁(silydianin)、水飞蓟亭(silychristin)、脱氢水飞蓟宾(dehydrosi-Silybin)、聚水飞蓟宾(Silybinomer)等木脂素黄酮类化合物[2]。以往研究主要集中在水飞蓟果实，对茎叶研究极少。为了进一步从水飞蓟茎叶中获取黄酮类成分, 采用多种色谱法从大孔树脂50%乙醇洗脱部位分离并鉴定了5个黄酮类化合物，这5个化合物均具有较强的抑制Fe2+半胱氨酸诱导的肝微粒体脂质过氧化作用。

1 仪器、色谱填料、试剂与药材

质谱：Agilent 1100系列LC/MSD Trap-SL型液质联用仪测定ESI-MS；核磁共振谱：BRUKER AV500-III核磁共振仪, 溶剂峰为内标; 分析型HPLC：Agilent 1100 Series 液相色谱仪：DAD-UV检测器; YMC C-18(150×4.6mm, 5μm), Diamonsil C18(250×4.6 mm,5μm); 制备型HPLC：Shimadazu LC-6AD, SPD-6A, SPD-10A 紫外检测器,SPD紫外检测器;YMC-Pack ODS-A(250×20 mm,10μm);中压制备液相：美国Biotage公司FLASH。薄层色谱硅胶GF254及柱色谱用硅胶(100～200目,200～300目), 均为青岛海洋化工厂生产；反相柱色谱硅胶RP-18(50μm), 日本YMC 公司生产；葡聚糖凝胶Sephadex LH-20为Amersham Pharmacia Biotech AB生产；大孔树脂D101型, 天津南开聚酰胺(30～60目)；水为市售去离子水,HPLC用娃哈哈纯净水, 屈臣氏纯净水所用分析纯试剂为北京化工厂生产。色谱溶剂：Dikma为美国Tedia公司生产;Fisher为美国Fisher公司生产；显色剂：10 % 硫酸乙醇溶液。药材经黑龙江中医药大学佳木斯学院陈效忠副教授鉴定为水飞蓟(Silybum marianumL.Gaertn)。

2 提取与分离

95%乙醇提取水飞蓟茎叶(30 kg), 得到浸膏(1.0kg), 浸膏经D101型大孔树脂，分别用蒸馏水，30%，50%，90%乙醇洗脱，50%洗脱部分经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱，甲醇-水(10:1～100:0)洗脱, 得到S1～S15组分，LC-MSn检测含有黄酮组分为S5和S8，S5用制备型HPLC分离纯化得到化合物1(10 mg), 2(8 mg)和3 (7 mg), S8用制备型HPLC分离纯化得到化合物4 (12 mg) 和5 (15mg)。

3 化合物结构鉴定

化合物1，黄色粉末, HCl-Mg反应阳性, FeCl3反应阳性。1H NMR (CDCl3, 500 MHZ): δ 6.32 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6)，6.45 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8), 7.75 (2H, d, J=8.5 Hz，H-2'和H-6')，6.90 (2H, d, J=8.5 Hz，H-3'和H-5')，5.32 (1H, br.s, H-1'')，3.10-4.00 (4H, m, 2''-5''), 0.85 (3H, d, J=5.7Hz, H-6'') ; 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): δ156.9 (C-2), 135.0 (C-3), 180.0 (C-4), 162.0 (C-5), 99.2 (C-6), 165.0 (C-7), 94.1 (C-8), 158.2 (C-9), 104.7 (C-10), 121.0 (C-1'), 131.0 (C-2'和C-6'), 115.7 (C-3'和C-5'), 160.5 (C-4'), 102.0 (C-1''), 71.0 (C-2''), 71.2 (C-3''), 71.8 (C-4''), 70.3 (C-5''), 17.6(C-6'')。以上数据与文献[3]报道一致，故鉴定化合物为山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(图1)。

化合物2，黄色粉末, HCl-Mg 反应阳性, FeCl3反应阳性。1H NMR (CDCl3, 500 MHZ): δ 6.42(1H, d, J=2.0 Hz, H-6)，6.85(1H, d, J=2.0 Hz, H-8), 8.10(2H, d, J=8.5 Hz，H-2'和H-6')，6.95(2H, d, J=8.5 Hz, H-3'和H-5')，5.55(1H, br.s, H-1'')，3.10-4.00 (4H, m, 2''-5''), 1.10(3H, d, J=5.7Hz, H-6'') ; 13C-NMR(CDCl3,125 MHz):δ147.9 (C-2), 136.0(C-3),177.0(C-4),161.0 (C-5), 98.9 (C-6),161.0 (C-7), 94.3 (C-8),155.2 (C-9),104.3 (C-10), 121.5 (C-1'),130.0 (C-2'和C-6'), 115.7 (C-3'和C-5'), 160.2 (C-4'),99.0.0 (C-1''), 70.0(C-2''),70.2(C-3''),71.5(C-4''),70.1(C-5''),18.1(C-6'')。以上数据与文献[4]报道一致，故鉴定化合物为山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖苷(图1)。

化合物3，黄色粉末,HCl-Mg反应阳性,FeCl3反应阳性。1H NMR (CDCl3, 500 MHZ):δ 6.42(1H,d,J=2.0 Hz, H-6),6.78(1H,d,J=2.0 Hz, H-8),7.80(2H,d,J=8.5 Hz，H-2'和H-6')，6.85(2H, d,J=8.5 Hz，H-3'和H-5')，5.35(1H,br.s,H-1'')，3.10-3.83(4H,m,2''-5''),0.83(3H,d,J=5.7Hz, H-6'')，5.54(1H,br.s,H-1''')，3.10-3.83 (4H, m, 2'''-5'''), 1.15 (3H, d, J=5.7Hz, H-6'''); 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): δ156.0 (C-2), 133.9 (C-3), 177.5 (C-4), 161.5 (C-5), 99.9 (C-6), 161.2 (C-7), 94.3 (C-8), 157.2 (C-9),105.3(C-10), 120.5 (C-1'), 130.5 (C-2'和C-6'), 115.9 (C-3'和C-5'), 161.2 (C-4'), 98.0 (C-1''), 70.2 (C-2''),70.5(C-3''), 71.6 (C-4''), 70.1 (C-5''), 17.1(C-6''),102.0.0(C-1''),70.1(C-2''),70.1(C-3''), 71.1 (C-4''), 70.0 (C-5''), 17.8 (C-6'')。以上数据与文献[5]报道一致，故鉴定化合物为山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷(图1)。

化合物4，黄色粉末, HCl-Mg反应阳性, FeCl3反应阳性。1H NMR (CDCl3, 500 MHZ): δ 6.15(1H,brs, H-6)，6.38(1H, brs,H-8),8.05(2H,d,J=8.5 Hz，H-2'和H-6')，6.92 (2H,d,J=8.5 Hz，H-3'和H-5');δ146.4 (C-2),135.9(C-3),175.8(C-4),160.6 (C-5)，98.7(C-6),165.6 (C-7),93.7(C-8),156.3(C-9),102.4(C-10),121.2(C-l'),129.3(C-2'，6'),115.5(C-3'，5'),159.3(C -4')。以上数据与文献[6]报道一致，故鉴定化合物为山奈酚(图1)。

化合物5，黄色粉末, HCl-Mg 反应阳性, FeCl3反应阳性。1H NMR (CDCl3, 500 MHZ): δ6.20 (1H, 2.0Hz, H-6)，6.50 (1H, 2.0Hz, H-8), 7.76 (1H, d, J=2.0 Hz，H-2')，6.70 (1H, dd, J=8.5, 2.0 Hz，H-6'), 6.92 (1H, d, J=8.5 Hz，H-5'); δ147.4 (C-2), 135.9 (C-3), 175.9 (C-4), 160.9 (C-5)，98.2 (C-6), 165.1 (C-7), 93.7 (C-8), 156.3 (C-9), 102.0 (C-10), 122.2 (C-l'),115.3(C-2'),148.5(C-3'),146.3(C-4'),117.9(C-5'),121.7(C-6'), 55.5 (-OCH3)。以上数据与文献[7]报道一致，故鉴定化合物为异鼠李素(图1)。

图1 化合物的结构

4 生物活性测定

采用Fe2+半胱氨酸诱导的肝微粒体脂质过氧化模型进行抗氧化活性筛选, 结果表明化合物1～5均有较强的抗氧化活性，IC50值分别为10.5,11.2,10.3,9.6,8.5 μM。

5 结论

从水飞蓟茎叶中首次分离得到5个黄酮类化合物，这5个化合物均具有较强的抗氧化活性，IC50值 8.5～11.2。本文的究对进一步明晰水飞蓟抗氧化活性成分有重要意义。

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黑龙江中医药大学佳木斯学院自主课题，编号：ZHY-Z29。

陈效忠(1962～)男，河北平泉人，学士，副教授。

张艳(1982～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，讲师。E-mail：tonyyan20081982@163.com。

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1008-0104(2015)04-0035-02

2015-03-02)