具有AHL 降解能力的海洋微生物的筛选与鉴定

赵 晶，李 天，金黎明，权春善

(大连民族学院 生物技术与资源利用国家民委－教育部重点实验室，辽宁 大连116605)

群体感应(quorum sensing，QS)是广泛存在于细菌个体及种群之间的信息交流机制，细菌能够感知自身合成信号分子的浓度变化，当信号分子浓度达到阈值时，能够启动一系列基因的表达，从而调控多种生物学功能，包括致病力、生物发光、抗生素的产生以及生物膜的形成等。酰基高丝氨酸内酯(acyl homoserine lactones，AHLs)是革兰氏阴性细菌的主要信号分子［1－3］。对AHLs 进行生物降解，能够有效抑制革兰氏阴性细菌的群体感应［4－6］，对于阻断病原菌的发病机制、降低其致病性具有重要意义。

自从在革兰氏阴性菌中发现AHL 调控的群体感应系统以来，研究者从陆生微生物中筛选、鉴定出多种具有AHL 降解能力的微生物［7－10］。但海洋中具有AHL 降解能力的微生物资源尚未得到充分开发。本研究从西南印度洋海泥中筛选具有AHL 降解能力的菌株，以丰富具有AHL 降解能力的微生物资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 海泥

本实验所用的海泥样品由中国大洋生物样品馆提供，采自西南印度洋海区，样品编号分别为DY115 －20V－S16 －TVG6、DY115 －20V －S12 －TVG4、DY115 － 21IV － S1 － TVG1 和DY115 －21IV－S11 －TVG8，实验室保藏。

1.1.2 报告菌株

报告菌株为紫色视杆菌Chromobacterium Violaceum 026，由新加坡分子与细胞生物学研究所Lianhui Zhang 教授馈赠。该指示菌为野生型紫色视杆菌的mini－Tn5 突变体，不能产生紫色色素。外源AHLs 能够激活其QS 系统(CviI/R)，使其产生紫色色素。

1.2 试剂

信号分子N － 己酰基高丝氨酸内酯(C6 －HSL)由本实验室制备，合成方法按照参考文献［11］进行。基因组DNA 提取试剂盒购自福际生物技术有限公司，PCR 用Taq 酶、dNTPs 等试剂及电泳用Marker、loading buffer 等试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 培养基

LB 培养基:蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸馏水定容至1 L，pH 7.2。培养基中加入2 %琼脂即为相应固体培养基。121 ℃灭菌15 min。

海洋微生物富集培养基:NaCl 1.0 g，KCl 0.5 g，MgCl20. 4 g，CaCl20. 1 g，Na2SO40. 15 g，K2HPO40.2 g，2 －吗啉乙磺酸(MES)1.0 g，蒸馏水定容至1 L，pH 5.5，121 ℃灭菌15 min。灭菌后在无菌环境下加入己酰基高丝氨酸内酯(C6 －HSL)0.5 g。

MM 培养基:KH2PO44.5 g，(NH4)2SO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO410.5 g，蒸馏水定容至1 L，pH 5.5，121 ℃灭菌15 min。

1.4 方法

1.4.1 菌株富集及分离纯化

以C6 －HSL 作为菌株生长的唯一碳源及能源，将制备的海洋微生物富集培养基分装于直径15 cm 的试管中，每管3 mL。将海泥样品以3 %的接种量接种于富集培养基中，于30 ℃、130 r·min－1摇床震荡培养1 周左右，连续3 次富集培养后的菌液在LB 琼脂培养平板上利用稀释涂布法和划线分离法进行分离纯化。

1.4.2 筛选菌株的AHL 降解能力检测

分离纯化后得到的菌株分别用接种环取一环，接于LB 培养基中，于30 ℃、180 r·min－1摇床震荡培养。取7 mL 对数晚期培养液于无菌离心管中，4℃、8 000 r·min－1条件下离心5 min。取100 μL 上清液于无菌EP 管中，加等体积MM 培养基和1 μL 的信号分子C6 －HSL 溶液(0.2 mg·mL－1)，30 ℃共培养4 h;同时，于离心后菌体沉淀中加入0.5 mL 无菌水使其充分悬浮。取100 μL 菌悬液于无菌EP 管中，加等体积MM 培养基和1 μL 信号分子溶液，30 ℃共培养4 h。报告菌株C. Violaceum 026 于LB 琼脂培养平板划线，30℃培养12 ～16 h。将LB 琼脂培养平板用灭菌小刀切割成4 条，排列整齐。在平板一侧点报告菌株C. Violaceum 026，菌株间隔为0.5 cm。在平板另一侧，距离最近的报告菌株点样1 cm 处按次序分别上样:无菌水5 μL、上清液与AHL 共培养物5 μL、菌体悬浮液与AHL 共培养物5 μL、1μg·mL－1的AHL 溶液5 μL，30 ℃培养箱过夜培养。48 h 后观察显色反应。

1.4.3 菌株形态鉴定

将具有较强AHL 降解能力的菌株分别于LB琼脂平板上划线，30℃过夜培养。菌落形态观察、革兰氏染色及芽孢染色按照微生物实验手册进行。

1.4.4 16S rDNA PCR 扩增和序列分析

利用基因组DNA 提取试剂盒提取具有AHL降解能力的菌株基因组DNA，以其为模板进行16S rDNA PCR 扩增。采用细菌16S rDNA 扩增通用引物，正向引物16S －8f:5' － AGAGTTTGATCCTGGCTCAG － 3'，反 向 引 物16S － 1525:5' －AAAGGAGGTGATCCAGCC － 3'。PCR 反 应 条 件为:95 ℃5 min;94 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃1 min，30 个循环;72 ℃10 min。PCR 产物经电泳检测后，由宝生物工程(大连)有限公司测序。将所测菌株的16S rDNA 序列与GenBank 核酸序列数据库中的序列进行比对。利用MEGA 5 软件进行同源性分析，建立系统发育树。

2 结果与讨论

2.1 样品富集培养及菌株分离纯化

利用富集培养基对海泥中微生物进行富集，一周后培养基变浑浊，证明海泥中存在能够利用AHL 的微生物。分离纯化后从西南印度洋海泥中共筛选出5 株可能具有C6 －HSL 降解活性的菌株，分别命名为S1、S2、S3、S4、S5(如图1)。

图1 分离纯化菌株的形态特征

2.2 所筛菌株的AHL 降解能力检测

将初筛所得的5 株海洋菌进行AHL 降解能力检测，以C.Violaceum 026 为报告菌株，以无菌水为阴性对照、C6 －HSL 为阳性对照，采用琼脂切条法进行AHL 降解能力确定(如图2)。可见S1、S4、S5 3 株菌培养液进行离心后，其上清液与C6 －HSL 的共培养物和菌体悬浮液与C6 －HSL 的共培养物均能使报告菌株C. Violaceum 026 显紫色，表明这3 株菌不能分泌降解C6 －HSL 的酶;相反地，S2、S3 的菌体悬浮液与C6 －HSL 的共培养物不能使报告菌显紫色，其上清液与C6 －HSL 的共培养物则能够使菌体显紫色。结果表明，S2、S3 菌株的菌体悬浮液具有很强的C6 －HSL 降解能力，可能含有胞内AHL 降解酶。

图2 菌株S1、S2、S3、S4、S5 AHL 降解能力鉴定

2.3 具有AHL 降解能力的菌株鉴定

2.3.1 形态特征鉴定

对S2、S3 菌株进行形态特征鉴定(见表1)，确定这2 株菌均为革兰氏阳性菌，属芽孢杆菌。

表1 S2、S3 形态特征鉴定

2.3.2 16S rDNA PCR 扩增和系统发育分析

对菌株S2、S3 的基因组DNA 提取后进行琼脂糖电泳(如图3)，以基因组为模板分别进行16S rDNA PCR 扩增(如图4)，电泳检测得到二条约1 500 bp的产物，与预期的大小一致。对S2、S3 的16S rDNA 测序，分别得到1 467 bp 大小的序列。将菌株S2、S3 的16S rDNA 序列与GenBank 中已登记的16S rDNA 序列进行同源性比对，发现S2、S3 与芽孢杆菌属的16S rDNA 自然类聚。

图3 S2、S3 基因组DNA 电泳图

图4 S2、S3 的16S rDNA PCR 产物的电泳检测

选取14 株与其同源性较高的序列，与菌株S2、S3 分别构建系统发育树(如图5)。可以发现S2、S3 与Bacillus amyloliquefaciens strain VJ －1 的亲缘关系最近。

图5 菌株S2、S3 以16SrDNA 为基础的细菌系统发育树

3 结 论

本研究主要对西南印度洋海泥中的AHL 降解菌进行筛选及鉴定。以C6 －HSL 为唯一碳源和能源对海泥中微生物进行富集，筛选得到5 株形态不同的菌株。采用琼脂切条检测法，利用紫色视杆菌C. Violaceum 026 对5 株菌进行AHL 降解能力检测，确定菌株S2、S3 可能含有胞内AHL降解酶。经菌株形态和16SrDNA 序列分析，菌株S2、S3 均为芽孢杆菌属。选取芽孢杆菌属14 个种的16s rDNA 基因序列构建系统发育树，菌株S2、S3 与B. amyloliquefaciens 的亲缘关系最近，初步确定这2 株菌为解淀粉芽孢杆菌。

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