霜霉菌侵染对三裂叶豚草叶绿体和木质素作用的影响

杨 红，吕国忠，赵志慧，孙晓东，刘绍芹，苏 丹

(1.大连民族学院 环境与资源学院，辽宁 大连116605;2.黑龙江八一农垦大学 会计学院，黑龙江 大庆163319)

外来入侵物种(invasive alien species，IAS)对自然生态系统、生物多样性造成了严重危害，中国仅几种主要外来入侵物种所造成的经济损失就高达574 亿元［1］。三裂叶豚草(Ambrosia trifida L. )又名大破布草，英文名giant ragweed，是菊科(Compositae)豚草属植物，原产北美，近年来在中国东北、华北地区不断蔓延危害［2］。三裂叶豚草植株的竞争和适应能力很强，其产生的花粉严重污染环境，对人类健康和作物生产形成巨大威胁，是高度危险的外来入侵物种。目前，三裂叶豚草的防治方法主要以化学防治和人工拔除为主，但随着抗磺草胺类除草剂三裂叶豚草种群的出现［3-4］，使化学防治也面临严峻挑战［5］。因此，寻找更为有效的防控方法一直是豚草防治的一项重要工作。专性寄生菌被很多研究者认为是非常好的生防因子［6-9］。早在40 年前北美洲就报道了普通豚草(A. artemisiifolia)上的霜霉病［10-11］，相继匈牙利有豚草霜霉病的发生［12-14］，之后刘绍芹等，报道了中国豚草轴霜霉菌引起的三裂叶豚草霜霉病［15］。从超微结构和分子细胞学角度研究病菌与寄主的相互关系是当代植物病理学中极受重视的研究领域之一［16-18］。苍耳轴霜霉菌是专性寄生菌，刘绍芹曾对包括玉米、小麦、水稻、大豆等23 种不同寄主接种苍耳轴霜霉菌，结果表明，该菌只能成功侵染苍耳，而对其他寄主无侵染力，因此可作为重要防治三裂叶豚草的生防菌资源［19］。

本文利用生物电镜技术和细胞化学方法对苍耳轴霜霉菌侵染过程中对寄主叶片中的叶绿体和木质素的影响进行初步探索，为深入研究苍耳轴霜霉菌的致病机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

将2012 年秋季于沈阳农业大学校园采集的健康、饱满的三裂叶豚草种子播种于直径9 cm 的温室花盆中，待幼苗长至2 ～4 对叶时接种。苍耳轴霜霉菌采集于2013 年5 月28 日至6 月15 日，加水配制成100 个·mL-1孢子悬浮液，采用喷雾法接种，保湿培养12 h 后，温室内继续培养，取发病叶片进行显微与超微结构观察。

1.2 木质素沉积的染色观察

分别将健康和感病的三裂叶豚草叶片用直径4 mm 的打孔器打成圆片，置于95 %酒精和冰醋酸(体积比1∶1)的混合液中固定24 h，再将材料放于饱和水合氯醛中透明一周后再转入无水乙醇中放置2 d，存于蒸馏水中。用1 mL 1 %间苯三酚(溶于70 %乙醇中)处理透明过的叶片组织3～6 min，吸干水，用1 mol·L-1的盐酸处理2 ～5 min，在恒温展台加热95 ℃30 min 以上，待叶片透明变色后观察［20］。

1.3 透射电镜样品的制备及观察

透射电镜样品的制备参考付洪兰的方法［21］。取新鲜的带有霜霉菌的病叶，将其切成1 ～2 mm的样品。用1 % ～5 %戊二醛前固定、1 %锇酸后固定，经丙酮逐级脱水、环氧树脂浸透、包埋剂包埋，通过超薄切片机制作5 ×10-1～7 ×10-1nm 的切片，自然干燥。用4 % 醋酸双氧铀与枸椽酸铅滴染后，进行JEM -2000EX 透射电子显微镜观察。

2 结果与分析

2.1 霜霉菌侵入后三裂叶豚草木质素沉积情况观察

经制片观察，霜霉菌侵染三裂叶豚草叶片后，正常叶片叶脉导管界限清晰(如图1a)，霜霉菌侵入叶片后导管间木质素沉积量明显增多，这表明霜霉菌的侵入，激发了三裂叶豚草叶片防御反应，侵染部位开始有木质素的沉积。由图1b 可以看到被侵染部位已严重木质化。

图1 病菌侵染对三裂叶豚草叶片木质素的影响

2.2 霜霉菌侵入后三裂叶豚草叶绿体的超微结构观察

通过对霜霉菌侵染的三裂叶豚草叶片的超微结构观察，发现正常细胞中的细胞器较多，叶绿体形状完整(如图2a);而霜霉菌可以破坏叶片组织，使叶绿体膜破碎，内含物流失而中空，从而导致叶片的光和能力降低，营养物质下降，植株生长受到抑制，但对线粒体无明显破坏作用(如图2b)。

图2 霜霉菌侵染对三裂叶豚草叶片叶绿体的影响

3 讨 论

木质素是植物体内一种重要的物理抗菌物质，在与病原菌相互作用中，寄主细胞壁木质化是抗病反应的特征之一，有强固细胞壁、保护细胞免受病原菌侵害的作用［22］。本研究中，霜霉菌侵染三裂叶豚草后，出现木质素明显沉积。这与黄瓜霜霉病菌侵染黄瓜叶片后木质素含量提高有相似之处［23］。木质素含量的提高可以提高叶片细胞壁的木质化程度，从而提高细胞壁的机械强度，阻止水分和营养向霜霉菌流动，在一定程度上限制霜霉菌侵染点向外扩散，控制病斑发展，同时大量木质素积累也阻止了叶片其他部位对受侵染部位水分和营养的供给，致使豚草叶片的光能利用率降低，产生营养物质的能力下降，三裂叶豚草的有效供给养分降低，从而抑制其营养生长及生殖生长。

通过对霜霉菌侵染后三裂叶豚草叶片结构的观察，发现霜霉菌侵染对三裂叶豚草叶片光合代谢产生了较大影响。霜霉菌可以破坏叶片组织，使叶绿体膜破碎，内含物流失而中空，导致叶片的光和能力降低，但对线粒体无明显破坏作用，这说明霜霉菌侵染三裂叶豚草后，先以破坏植物叶绿体为主。而苍耳柄锈菌侵染三裂叶豚草后，当叶片细胞即将坏死时，一些细胞器如线粒体、高尔基体等已先于叶绿体解体，使叶绿体中的淀粉粒逐渐减少，最终随叶绿体的解体而迅速消失，进而改变了细胞膜的通透性，使细胞内容物流失，最后导致细胞崩解，严重破坏三裂叶豚草的生长发育［24］，这与本研究中叶绿体先于线粒体受损的结果不一致。病菌侵入植物叶片后，往往都会不同程度造成寄主细胞器结构、功能上的损伤［18，25，26］，但致病菌及寄主互作机制却会存在一定差异。由于豚草霜霉菌目前只能利用寄主繁殖，其发病条件会受到各种环境因子的影响，因此，有关霜霉菌侵染三裂叶豚草的组织细胞学变化还需深入研究，特别是有关苍耳轴霜霉菌与三裂叶豚草之间的互作关系，将是充分发挥霜霉菌作为三裂叶豚草生物防治潜力因子的重要研究内容。

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