甲醛对卤虫的急性毒性研究

张文博，吴 闯

（辽宁石油化工大学 化学化工与环境学部，辽宁 抚顺 113001）

甲醛对卤虫的急性毒性研究

张文博，吴 闯

（辽宁石油化工大学 化学化工与环境学部，辽宁 抚顺 113001）

为评估甲醛对水环境的毒性影响，以美国大盐湖卤虫为受试生物，采用概率单位法研究了甲醛对卤虫的急性毒性效应。结果表明：在25 ℃条件下，甲醛对卤虫的24 h LC50为16.765 mg·L-1，95%置信限度：15.105～18.277 mg·L-1；48 h LC50为4.783 mg·L-1，95%置信限度：4.450～5.105 mg·L-1。培养48 h甲醛对卤虫的致死作用比24 h显著增加，且48 h浓度响应范围也小于24 h响应范围。同时发现卤虫中毒后症状与已报道的其他物质中毒症状有所不同。

甲醛；卤虫；急性毒性；概率单位法

甲醛常温下是一种无色、有强烈刺激性气味的气体，易溶于水及醇、醚等多种有机溶剂。近年来，由于生活水平的提高，由室内装修和各种消费品使用造成的室内甲醛污染已经引起人们的高度重视，其对人体及小鼠等生物的毒性危害及中毒机制已经进行了大量研究[1,2]。同时，甲醛作为一种重要的有机原料在工业上的广泛应用，产生了大量含甲醛废水，对环境的危害同样巨大，因此甲醛对水体的污染及其对水生生物毒性也在日益引起关注[3]。目前对于水生生物的毒性研究多见于水产养殖品种及个别模式生物[4-6]。卤虫作为一种环境监测生物，其急性毒性试验已经被国际会议确定并标准化[7]。其具有生活周期短、对毒物敏感、易于保存和培养等优点，已被广泛用于水生生物毒理学研究中。本文以大盐湖卤虫卵为对象，进行甲醛对卤虫急性毒性的研究，为水体环境监测及甲醛废水处理提供实验依据及生物学参考。

1 实验部分

1.1 受试生物

以美国大盐湖卤虫（Artemia.francisana）作为受试生物，购自天津中盐制盐工程技术研究院。与国产卤虫卵相比，大盐湖卤虫卵质量更高，孵化率和成活率都较高，且更易培养。卤虫卵在光照培养箱中孵化，孵化条件为(25±1)℃，2 000 lux光照，光照时间比为12:12（光照，黑暗），小型气泵充气搅拌。选取24 h内孵出的卤虫，转移至另外容器在相同的条件下继续培养24 h，得到Ⅱ～Ⅲ龄的卤虫无节幼体。

1.2 试剂

甲醛分别采用37%水溶液（福尔马林）和甲醛溶液标准物质（100μg/mL，100 mL）购于北京盈泽纳新化工技术研究院。

1.3 实验用水

实验用水采用人工海水，pH= 8.0±0.5，盐度（35 ±1）‰，其组成为： 23.70 g·L-1NaCl、0.54 g·L-1KCl、6.29 g·L-1MgSO4·7H2O、4.5 g·L-1MgCl2·6H2O、0.15 g·L-1CaCl2、0.04 g·L-1NaHCO3和蒸馏水[8]。

1.4 预试验

用人工海水将福尔马林稀释成不同浓度，稀释前提高人工海水盐度，使稀释后盐度为（35±1）‰。于50 mL小烧杯中加入25 mL甲醛溶液，投入10只卤虫幼体，分别在24 h和48 h观察死亡情况，找出48 h使全部卤虫未发生死亡的最高浓度和24 h全部死亡的最低浓度，以确定试验所需浓度范围。

1.5 急性毒性试验

在300 mL烧杯中加入150 mL实验用甲醛人工海水溶液，该溶液由甲醛标准物质配制至相应浓度。每只烧杯投入30只Ⅱ～Ⅲ龄的卤虫无节幼体。每个水平设置2个平行组，取平均值作为结果，同时设空白对照。在光照培养箱内恒温培养，(25±1)℃，2 000 lux光照，光照时间比为12:12（光照，黑暗）。实验过程中不投饵不充气。分别于培养24 h和48 h记录各组卤虫死亡数量，在解剖镜下观察，以10 s内卤虫幼体无明显运动作为死亡判断标准。用SPASS19.0进行数据分析，用概率单位法求出24 h LC50和48 h LC50。

2 结果与分析

2.1 预试验确定甲醛浓度范围

经过预试验，确定培养24 h和48 h甲醛浓度范围分别如表1所示。在此范围，死亡率随浓度增加有明显变化。

2.2 卤虫的中毒症状观察

试验中发现，卤虫中毒后有一段平稳期，泳动情况与对照组相比无异常，浓度越高这段平稳期越短。平稳期过后，泳动速度明显加快，最后短时间内减慢至失去运动能力，沉入水底。对于甲醛中毒，卤虫失去运动能力和死亡之间几乎无过渡。

表1 试验用甲醛浓度Table 1 Concentration of formaldehyde in test mg·L-1

卤虫对甲醛的中毒症状与其他物质的中毒症状有所不同，如柴油使卤虫活动能力下降，运动迟缓直至沉在水底不停颤动[9]；恩诺沙星也可以使卤虫出现运动迟缓，肢角摆动频率下降，趋光性变弱的现象[10]；而甲醛使卤虫运动更加活跃，并且极大缩短了从活动减慢到死亡的时间，一旦沉入水底基本已经死亡。这种差异显示甲醛中毒和其他物质中毒机理的不同，但具体机理如何，尚未见明确报道。本试验采取的死亡判定方法为观察卤虫10 s内不动即为死亡，正是以卤虫上述中毒特点为依据，使得试验更加简单易行。这一点与有些报道所采用的针刺的方法有所不同[9]。

2.3 急性毒性试验结果

将试验结果用SPSS19.0软件分析，表2为采用概率单位法计算24 h和48 h每组试验数据残差及相应的致死概率。其中浓度为取对数后的结果。

表2 单元计数和残差Table 2 Cell count and residual

表3为经过回归计算后24 h和48 h各浓度预测值对应的死亡概率及其95%置信限度，为节省篇幅未全部列出。由表中可以看出，两个时间组的死亡率均随浓度增加而上升，但在24 h组中，发生死亡的浓度范围较大，即随浓度的增加死亡率上升较慢；在48 h组中，发生死亡的浓度范围比较集中，即在该浓度范围内，死亡率随浓度增加迅速上升。

表 4为软件最后给出的回归模型，Pearson 拟合度检验结果表明概率单位与浓度对数曲线相关性显著，所以回归模型完全符合要求。24 h LC50为16.765 mg·L-1，95%置信限度：15.105～18.227 mg·L-1；48 h LC50为 4.783 mg·L-1，95%置信限度：15.105～18.227 mg·L-1。

表3 置信限度Table 3 Confidence limits

甲醛毒性的研究较多见于哺乳动物如小鼠和人等，对水生生物的毒性研究相对较少。卤虫作为受试生物已经被广泛的应用于水环境污染物的毒性评价和生态毒理学的研究[11]。它具有个体小、对环境变化反应灵敏、易于长期保存和实验操作，并且可在实验室内大量培养等特点，因而比其他水生受试生物如大型水蚤、贝类、斑马鱼等更具优势[12]，已被用来评估钻井液[13]、重金属离子[14]、农药[8]等有毒物质及某些藻类[15]的生物毒性。有研究表明，甲醛对水蚯蚓的24 h LC50为24.28 mg·L-1，48 h LC50为20 mg·L-1[4]；对泥鳅的24 h LC50为461.23 mg·L-1，48 h LC50为425.32 mg·L-1[5]溞；对中华虎头蟹Ⅱ期 状幼体24 h LC50为 131.036 µL·L-1，48 h LC50为 110.296 µL·L-1[6]。相比之下，卤虫对甲醛更加敏感，更适于对水中甲醛进行生物监测。

表4 甲醛对卤虫幼体急性毒性效应Table 4 The acute toxicity of formaldehyde on Artemia.francisana

市售甲醛试剂一般为37%～40%的甲醛溶液，其中为防止甲醛聚合有些产品中加入15%左右的甲醇作为阻聚剂。为保证试验结果的准确，本试验中在预试验阶段采用的市售甲醛试剂初步确定死亡浓度范围，在正式试验中采用甲醛溶液标准物质，其中甲醛含量较低抑制了聚合现象，并且浓度精确不含阻聚剂，可直接用于试验而无需再次标定。目前一些文献中的甲醛浓度实际是甲醛溶液浓度，对其毒性的评价与纯甲醛相比是有区别的。

本试验的数据处理采用 SPSS19.0软件，它和SAS、BMDP并称为国际上最有影响的三大统计软件。在国际学术交流中，凡是用 SPSS软件完成的计算和统计分析，可以不必说明算法，其统计结果被国际同行广泛认可。该软件能根据回归模型，计算出各浓度对应的概率，并给出95%置信限度，在进行半致死浓度研究中非常方便。

3 结 论

甲醛对卤虫的24 h LC50为16.765 mg·L-1，95%置信限度：15.105～18.227 mg·L-1；48 h LC50为4.783 mg·L-1，95%置信限度：15.105～18.227 mg·L-1。卤虫对甲醛敏感，适于用来对其进行生物监测。中毒48h对应的死亡浓度范围明显小于中毒24 h，且甲醛中毒症状与其他物质中毒症状不同，具体机理有待进一步研究。

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Study on Acute Toxicity of Formaldehyde on Artemia.francisana

ZHANG Wen-bo，WU Chuang
（College of Chemistry, Chemical Engineering and Environmental Engineering, Liaoning Shihua University, Liaoning Fushun 113001，China）

For evaluating the toxicity of formaldehyde in aquatic environment, Artemia.francisana was used as test organism to study the acute toxicity of formaldehyde by probit method. The results show that, at 25 ℃ the 24 h LC50is 16.765 mg·L-1, and its 95% confidence limit is 15.105～18.277 mg·L-1; the 48 h LC50is 4.783 mg·L-1, and its 95% confidence limit is 4.450～5.105 mg·L-1. The lethal effect of formaldehyde after 48 h culture is more significant than that of 24 h, and the concentration response range is also the same. The behavior response of Artemia.francisana to formaldehyde is different from other reagents reported.

Formaldehyde; Artemia.francisana; Acute toxicity; Probit

X 835

A

1671-0460（2015）08-1788-03

2015-07-13

张文博（1994-），男，辽宁沈阳人，研究方向：生物化工。E-mail：zhangwbbio@sina.com。

吴闯（1973-），男，硕士，研究方向：生物工程。E-mail：wuchuang2000@sina.com。