龙血树根腐病病原菌的鉴定

谢昌平， 李博勋， 文衍堂， 郑妃庆， 黄贵修*

（1.海南大学环境与植物保护学院，海口 570228；

2.中国热带农业科学研究院环境与植物保护研究所，海口 571101）

龙血树根腐病病原菌的鉴定

谢昌平1， 李博勋2， 文衍堂1， 郑妃庆1， 黄贵修2*

（1.海南大学环境与植物保护学院，海口 570228；

2.中国热带农业科学研究院环境与植物保护研究所，海口 571101）

龙血树根腐病是一种系统性病害，该病引起植株地上叶片由黄色变为褐色，根部的皮层和木质部分离，木质部表面有白色的霉层，维管束呈红棕色坏死，后期病根褐色腐烂。从发病的植株根部分离、纯化病原菌，经致病性测定、形态学、培养性状观察和rDNA-ITS序列的分析鉴定表明，引起龙血树根腐病的病原菌为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporumSchl.）。

龙血树； 尖孢镰刀菌； 形态学和培养性状； rDNA-ITS； 鉴定

龙血树（Dracaena angustifoliaRoxb.）属百合科（Liliaceae）、龙血树属（Dracaena）［1］。在我国主要分布在云南、广西、海南及台湾地区［2］。其植株不仅具有独特的园林景观价值，而且还具有很强的吸收有毒有害物质的能力，可清新室内空气。因此，龙血树被广泛置于厅堂、客房和酒店等公共建筑内，以增加室内绿色和雅趣［3］。龙血树的木质部在受外力损伤或遭真菌侵入后分泌的红色树脂，被称为“龙血”，部分品种是提炼名贵中药“血竭”的原料植物［4］。国内已经报道的龙血树病害有炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）、褐斑病（Leptosphaeria draconis）、可可球二孢叶斑病（Botryodiplodia theobromae）、拟茎点霉叶斑病（Phomopsis dracaen-icola）、弯孢霉灰斑病（Curvularia lunata）、弯孢霉褐斑病（Curvularia senegalensis）、拟盘多毛孢叶斑病（Pestalotiopsis clavispora）、拟茎点霉灰斑病（Phomopsis dracaenae）、球壳孢叶枯病（Sphaeropsis dracaenae）、顶多毛孢叶斑病（Bartalinia dracaenae）［5］以及龙血树茎腐病（Thielaviopsis paradoxa）［6］、龙血树白绢病（Sclerotinmrolfsii）［7］和龙血树灰霉病（Botrytis cinerea）［8］。目前，笔者在海南省海口附近的多个龙血树花圃中发现一种危害根部的病害，严重地块发病率可达到30%～50%。大量龙血树发病，根部严重腐烂，失去观赏价值，严重影响龙血树生产。本试验对该病的病原菌做了鉴定，以期为病害的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

发病材料来自海口市琼山区演丰镇龙血树花圃基地的典型病株。

1.2 症状描述

按常规方法对田间病株症状和横切病根后内部症状进行描述并拍照。

1.3 菌株的分离与纯化

采用常规组织分离法分离［9］，取发病典型的病根，剥下皮层，切取大小为4～5 mm的组织块，用70%的乙醇浸数秒后，用0.1%升汞表面消毒1～2 min，然后用无菌水冲洗3次，将其转移至马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上，置于28℃全光照恒温培养箱内培养，观察病原菌的生长情况。待菌种产孢后，采用琼脂平板稀释纯化法进行纯化［10］。将纯化的菌株转入试管斜面保存。

1.4 菌株的致病性测定

用纯化的菌株接种种植在经121℃灭菌1 h基质中的1年生龙血树健康组培种苗的根部。接种时剖开根部表土露出根部，用灭菌针刺伤根部。挑取菌丝块放入无菌水中将孢子洗脱，用血球计数板测定孢子悬浮液浓度，用无菌水将孢子悬浮液浓度调至104个孢子/mL。取孢子悬浮液20 mL浇灌在根部的伤口处，填回基质后正常管理。共处理10株。同时，选5株用灭菌水浇灌根部有伤口的植株作为对照，观察并记录发病情况。

1.5 病原菌形态观察

将纯化后的病原菌分别接种到PDA和马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）和米饭培养基上，培养一段时间后，观察菌落的培养性状，包括菌落的形状、颜色和有无气生菌丝等；病原形态的观察包括分生孢子的类型、形状、大小、色泽、分隔数和大小等。

1.6 病原菌rDNA-ITS序列的PCR扩增和分析

1.6.1 基因组DNA的提取

采用CTAB提取总DNA［11］。

1.6.2 病原菌rDNA-ITS序列扩增

通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。由上海英骏生物技术有限公司合成。

PCR反应体系：dd H2O 18μL、10×buffer 2.5μL、dNTP（2.5 mmol/L）1μL、ITS1（10pmol/L）1μL、ITS4（10 pmol/L）1μL、TaqDNA聚合酶（2.5 U/μL）0.5μL、模板DNA（0.5 ng/μL）1μL，总体积25μL。PCR反应参数：94℃预变性5 min；94℃变性30 s；60℃退火1 min；72℃延伸1 min；35个循环；72℃完全延伸10 min。反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6.3 病原菌rDNA-ITS序列同源性比较

根据致病性测定结果，选择致病菌株D2进行序列测定，并运用核酸数据库中的BLAST工具软件，在DNA序列数据库中搜索同源DNA序列并进行比较分析，根据BLAST搜索和比较的结果，进行同源性分析。

2 结果与分析

2.1 田间症状描述

地上部分的症状：叶片由绿色变为浅黄色，叶片下垂，下层叶片逐渐由浅黄色变黄色，继而变为黄褐色至褐色，最后干枯。叶片缺乏光泽，呈缺水状（图1a～c）。

地下根部的症状：多从根尖或根部分叉处开始发病，发病初期病根变为水渍状棕黄色，病根很快坏死，并由根尖逐渐向主根扩展，随着病部的进一步扩展，病根腐烂，其皮层与木质部极易分离，将分离的皮层剥去，可见内部的木质部也变为棕黄色，在发病中后期病根木质部上可见白色的霉层，显微镜检查可见大量的大型分生孢子、小型孢子、分生孢子梗和菌丝体。横切病根可见病根的维管束变为红棕色坏死（图1d～f）。最后病根全部腐烂，散发臭味。

2.2 菌株的致病性测定

将分离纯化后的菌株D1和D2分别接种到健康的根上，经过30～45 d的观察，接种D2菌株的植株叶片由绿色逐渐变为浅黄色，叶片下垂，继而变为黄褐色至褐色，根变为水渍状棕黄色，逐渐坏死，其发病率100%（发病株数/接种株数：10/10）（图1g～i）。而接种D1菌株的植株和对照株均健康（发病株数/接种株数分别为0/10和0/5）（图1j）。从发病的根部分离到D2菌株，符合柯赫氏法则。

图1 龙血树根腐病的田间症状和人工接种的症状Fig.1 Symptoms ofDracaena angustifoliaroot rot disease in the field and after artificial inoculation

2.3 病原菌形态特征

病原菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上25℃培养4 d后菌落直径48～55 mm；菌丝体为羊毛状，放射状条纹不明显；少有气生菌丝，气生菌丝棉絮状，有少量团絮；菌落背面呈桃红色至紫红色，仅产生小型分生孢子，不产大型分生孢子。在马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）上25℃培养4 d后菌落直径47～53 mm；菌丝体为羊毛状，放射状条纹明显；气生菌丝棉絮状，繁茂，团絮多；菌落背面呈玫瑰红至深紫红色。容易产小型分生孢子，产少量大型分生孢子。在米饭培养基上气生菌丝繁茂，棉絮状，易团絮，菌落背面玫瑰红，易产生大型分生孢子。大型分生孢子无色，镰刀形，顶端细胞窄细呈喙状弯曲，足胞不太明显，3～5个分隔，一般为3个分隔，大小为3.5～5.5（4.6）μm×25.5～40.6（34.7）μm；小型分生孢子卵形、椭圆形或肾形，一般无分隔，极少数有1个分隔，大小为4.7～11.4（7.1）μm×2.2～3.8（2.7）μm（图2a）。厚垣孢子大量，多单生、少数顶生，球形，直径为7.5～13.4（8.6）μm（图2b）。根据形态学特点和相关资料［12-15］初步确定该病原菌为镰刀菌属（Fusarium）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporumSchl.）。

图2 龙血树根腐病菌的形态Fig.2 Morphology of the pathogen causing root rot onD.angustifolia

2.4 病原菌rDNA-ITS的分子鉴定

将克隆和测序得到的致病菌株D2的rDNA-ITS序列（GenBank登录号：EF495230.1）在NCBI进行BLAST比对，结果显示：待测菌株rDNA-ITS与Fusarium oxysporum（GenBank登录号：EF495230.1、AY18-8919.1、JF776163.1、DQ452450.1和DQ452454.1）的同源性达到100%。结合形态学特征，确定引起龙血树根腐病的病原菌为尖孢镰刀菌（FusariumoxysporumSchl.）。

3 讨论

通过对种植地的调查，发现海口市琼山区演丰镇龙血树花圃基地的土壤类型以沙壤土为主，前作较为复杂，有些地块前作是香蕉和荔枝，有的地块是灌木杂草。种植香蕉的地块是否曾经发生过香蕉枯萎病以及是否与龙血树根腐病的发生有一定关系仍有待进一步研究。

该病一年四季均可发病，但在夏秋季高温季节症状较明显，发病较重。同时，我们发现该病原菌主要通过根部的伤口和根尖侵入而引起发病。在栽培管理上，应尽可能减少根部的机械伤口，以减少病原菌的侵入。

本试验从海口琼山区演丰镇3个花圃取样20余株病株，此外从龙云镇、三门坡镇也取样数次，并分离病原菌，从根部分离出2种镰刀菌菌株，其中1种是致病菌。通过对病原菌的形态学分析和rDNA-ITS序列测定，将病原鉴定为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。由尖孢镰刀菌引起龙血树根腐病在国内尚属首次报道。

尖孢镰刀菌寄主范围广泛，可引起西瓜、黄瓜、香蕉、辣椒和番茄等100多种植物发生毁灭性的枯萎病，导致严重的经济损失［16］。该菌为典型的土传病害真菌，属土壤习居菌，是一类在土壤和有机质中数量多而活跃的病原菌［17］。因此，在该病害防治上首先应选用无病菌土壤，并采取轮作等措施。

［1］ 陈心启.中国植物志［M］.北京：科学出版社，1980：274 278.

［2］ 李永杰，莫饶，唐燕琼，等.中国龙血树SRAP遗传多样性分析［J］.热带作物学报，2012，33（4）：617 621.

［3］ 董美超，莫饶，唐燕琼，等.海南龙血树的核型分析［J］.热带作物学报，2011，32（4）：583 589.

［4］ 何兰，王竹红，屠鹏飞，等.龙血树属植物化学及药理活性研究进展［J］.中草药，2004，35（2）：222 228.

［5］ 习平根，戚佩坤，姜子德.香龙血树真菌病害的鉴定［J］.华南农业大学学报（自然科学版），2002，23（7）：31 57.

［6］ 冯家望，莫晓凤.香龙血树茎腐病的调查与鉴定［J］.植物检疫，1997，11（3）：148 150.

［7］ 邢梦玉，杨光穗.龙血树白绢病病原的鉴定及生物学特性研究［J］.热带农业科学，2009，29（12）：27 38.

［8］ 肖华.别让灰霉病“污染”香龙血树［J］.花木盆景（花卉园艺版），2004（11）：25.

［9］ 孙广宇，宗兆锋.植物病理学实验技术［M］.北京：中国农业出版社，2002：142 144.

［10］方中达.植病研究方法［M］.第3版.北京：中国农业出版社，1998：122 123，53.

［11］谭树华.分子生物学实验与指导［M］.北京：中国医药科技出版社，2003：24 27.

［12］Burgess L W，Summerell B A，Bullock S，et al.Laboratory manual forFusariumresearch［M］.Sydney；University of sydney Press，1994：119 121.

［13］Leslie J F，Summerell B A，Bullock S.TheFusariumlaboratory manual［M］.Iowa：Blackwell Publishing Ltd，2006：145 146.

［14］Booth C.The GenusFusarium［M］.England：CMI，Kew，Surrey，1971.

［15］贺冰，杨莉榕，王建明，等.山西省重要作物萎蔫病病原镰刀菌（Fusarium）种类的鉴定（Ⅰ）［J］.山西农业大学学报，2006（2）：190 200.

［16］刘芸，朱育菁，陈清西，等.灰黄霉素对尖孢镰刀菌抑制作用的研究［J］.中国农学通报，2011，27（27）：282 288.

［17］林先贵，张华勇，尹睿，等.不同栽培条件下蔬菜塑料大棚土壤尖孢镰刀菌数量的变化［J］.土壤学报，2008，45（1）：138 142.

Identification of root rot pathogen onDracaena angustifolia

Xie Changping1， Li Boxun2， Wen Yantang1， Zheng Feiqing1， Huang Guixiu2
（1.College of Environmental and Plant Protection，University of Hainan，Haikou570228，China；2.Institute
of Environment and Plant Protection，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou571101，China）

Root rot ofDracaena angustifoliaRoxb.is a systemic disease.The diseased leaves ofD.angustifoliachanged from yellow to brown，The xylems of the roots separated from the cortexes.The surface of the xylems covered white mold.The vascular bundles were necrosis with reddish brown.The diseased roots were brownish rot at later stage.The pathogen was isolated from the roots，purified from the infectedD.angustifoliaand its pathogenicity was tested.Morphological characters，culture characters and rDNA-ITSsequence analysis indicated that the pathogen wasFusarium oxysporumSchl.

Dracaena angustifolia；Fusarium oxysporum； morphology and culture characters； r DNA-ITS；identification

S 436.8

A

10.3969/j.issn.0529 1542.2015.01.025

2014 01 19

2014 04 10

海南省科技基金项目（Rnd0524）

*通信作者 Tel：0898 66969219；E-mail：hgxiu@vip.163.com