营养因子对药用植物愈伤组织中次生代谢产物积累的影响

张 乐，朱 虹,，房慧勇，张春红,，李旻辉,

（1. 包头医学院，内蒙古 包头 014060；2. 内蒙古自治区特色药用植物培育与保护工程技术研究中心，内蒙古 包头014060；3. 河北大学中医学院，河北 保定 071000）

营养因子对药用植物愈伤组织中次生代谢产物积累的影响

张 乐1，朱 虹1,2，房慧勇3，张春红1,2，李旻辉1,2

（1. 包头医学院，内蒙古 包头 014060；2. 内蒙古自治区特色药用植物培育与保护工程技术研究中心，内蒙古 包头014060；3. 河北大学中医学院，河北 保定 071000）

植物次生代谢产物是由植物通过次生代谢产生的一类细胞生命活动或生长发育正常运行的非必需化合物。自然界许多药用植物的有效成分都是植物次生代谢的产物。随着药用植物市场需求的增大，野生植物资源逐年减少，利用愈伤组织获得次生代谢产物是目前解决供不应求最为行之有效的方法。通过查阅近几年的国内外文献，综述了营养因子对药用植物愈伤组织中次生代谢产物积累的影响，以期为进一步研究提供参考。

营养因子；药用植物; 愈伤组织；次生代谢产物

植物次生代谢产物是由次生代谢产生的一类细胞生命活动或生长发育正常运行的非必需小分子化合物。其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性，在植物生长、发育和生理功能方面发挥着重要作用。自然界多数药用植物的有效成分都是其次生代谢的产物，其中萜烯、酚、生物碱类化合物是植物中最重要的次生代谢产物，其合成受到环境等多种因素影响[1]。近年来，随着药用植物的市场需求不断增大，给自然环境和资源造成了很大的压力，野生药用植物资源逐年减少，有的甚至趋于濒危，因此，开展人工培养迫在眉睫。在植物组织培养中，利用愈伤组织培养获得目标产物，具有成本低、不受自然条件影响的优势[2]。影响愈伤组织中次生代谢产物的积累因素有很多，其中营养因子是影响药用植物有效成分产生的最重要因素。不同种类、不同含量和不同组合的营养因子对愈伤组织中次生代谢产物的积累有很大的影响。营养因子包括有机元素和无机元素、营养添加物、糖类、氨基酸、氮源等。阐述营养因子对药用植物愈伤组织中次生代谢产物积累影响的研究概况，为今后更深入地研究药用植物和合理开发利用药用植物资源奠定基础。

1 培养基

培养基的选择对植物愈伤组织的生长起着决定性作用。常用的培养基有MS、B5、White等。不同的培养基，对愈伤组织中次生代谢产物的积累量也不相同，因此，要根据不同外植体的需要，选择合适的培养基。用MS、B5、NT、H、1/2 MS、6, 7-V和White 7种培养基培养雷公藤愈伤组织，结果显示，愈伤组织在6, 7-V培养基上生长量最大，并明显改善褐化现象，但有效成分含量较低，在White培养基上雷公藤内酯醇及雷公藤总生物碱含量最高[3]。根茎克隆植物Hydrocotyle bonariensis能合成大量类黄酮物质，选择合适的培养基将有助于其积累，DKW培养基最适合类黄酮的产生，产生类黄酮干重最大量达到8.32 mg/g，而在MS、NN培养基中，类黄酮的含量显著的低。DKW促进次级代谢产物积累的原因可能是其含有高浓度的磷酸盐[4]。

组织培养的培养基一般可以分为含盐量高的、高硝酸钾、中等无机盐和低盐四种类型。杜仲愈伤组织的增长量在高硝酸钾类型的B5、N6培养基上远高于其它类型培养基。且这两种培养基的愈伤组织中次生代谢产物含量差异不明显，总黄酮的含量和产量也均以愈伤组织增长量最高的两种高硝酸钾培养基最高，以愈伤组织增长量最低的White培养基最低[5]。当用MS、B5、SH、WH四种培养基培养东革阿里愈伤组织，分析9-methoxycanthin-6-one含量的时候，经过5个星期的培养，MS培养基中含有的9-methoxycanthin-6-one量最大为3.84 mg/g，其次为B5、SH、WH，量分别为1.54 mg/g、1.46 mg/g、0.92 mg/g。即使都选用一样的MS培养基，但如果组成MS的营养成分含量不相同，产生的9-methoxycanthin-6-one含量也不同，例如，选用1/4 MS、1/2 MS、1 MS、2 MS的培养基培育东革阿里愈伤组织，从1/4 MS中测得的9-methoxycanthin-6-one量最大为4.97 mg/g，是2 MS(0.7 mg/g)含量的7倍，含9-methoxycanthin-6-one的量从大到小顺序为1/4 MS、1/2 MS 、1MS 、2MS[6]。

在适合生长的培养基中培养的愈伤组织超过一定的生长时期，次生代谢产物的合成量也会受到影响。最适合沙枣愈伤组织生长和缩合鞣质积累的培养基是MS，添加激素组合1.0 mg/L 2, 4-D+0.5 mg/L 6-BA的条件下，愈伤组织生长快，但当愈伤组织开始分化时，缩合鞣质的含量明显下降[7]。

培养基中含有大量营养成分，包括琼脂、蔗糖、常量元素和微量元素等。培养基中常量元素和微量元素的含量对植物愈伤组织的生长和次级代谢产物含量具有影响，使用最适的浓度才能获得较高产量。聂秀霞等[8]研究表明，培养基中常量元素和微量元素对彭泽贝母愈伤组织增殖和生物碱含量有一定的影响。常量元素以N、P、K、Ca为试验因素，通过改变这四种元素的含量，来观察愈伤组织的生长情况和生物碱积累的变化。结果表明，在加入0. 015 mol/L N、0. 013 mol/L P、0. 008 mol/L K和0. 002 mol/L Ca的组中，愈伤组织生长率最小，为38. 11%，是最大生长率的35. 2%，但生物碱的含量是最高的，为0. 163%。生物碱含量最低的一组是0. 03 mol/L N、0. 013 mol/L P、0. 016 mol/L K和0. 001 mol/L Ca组，仅为0. 04%。通过对九组不同组合的实验可得出结论，四种元素对彭泽贝母愈伤组织生物碱积累影响的大小为K>N>Ca>P。将彭泽贝母愈伤组织分别接种到不添加Fe、Mn、B、Mo、Zn、I、Co、Cu等元素的培养基中40 d后取出测量生物碱含量，以MS培养基为对照，以此来观察微量元素的影响。实验结果表明，缺Zn、Fe时生物碱含量达到最高量0. 234%，然而不加I或Cu则不利于生物碱的积累。

2 碳源

碳源是愈伤组织生长和次生代谢产物积累必不可少的物质，蔗糖是应用最广泛的碳源，其次还有果糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨醇等。培养基中加入不同种类的碳源，愈伤组织的生长情况和次生代谢产物的积累都有很大的不同。

在印度楝中，当培养基中的蔗糖为30 g/L时，川楝类似物的含量达到最大7.024 mg/mL，同样，当添加的葡萄糖为30 g/L时，其含量也是最大的[9]。在MS培养基中分别加入1%~5%的蔗糖、果糖、葡萄糖、山梨糖醇和甘露醇，检测东革阿里愈伤组织中9-methoxycanthin-6-one含量时发现，当果糖含量为2%~4%时，促进9-methoxycanthin-6-one的生成，含量为4.59 mg/g，然而，在加入高浓度蔗糖的培养基中，愈伤组织中9-methoxycanthin-6-one的含量比较低。加入低浓度甘露醇的培养基中，愈伤组织中9-methoxycanthin-6-one的含量较高，加入3%甘露醇时含量最高[7]。

同种碳源，由于浓度的不同，也会对次生代谢产物的积累产生很大的影响。将蔗糖浓度从20 g/L增加到60 g/L，长春花愈伤组织的生物量和吲哚生物碱含量都明显增加，但是，当蔗糖浓度调到70 g/L或80 g/L时，生物量和吲哚生物碱的含量都明显下降；最适宜生物量和吲哚生物碱积累的蔗糖浓度为50 g/L或60 g/L[10]。

糖不仅起到碳源的作用，而且具有调节渗透压的作用，因而对愈伤组织生长和次生代谢产物的含量具有明显影响。对雷公藤愈伤组织增长量和雷公藤内酯醇含量的影响实验表明，蔗糖对雷公藤愈伤组织的增长量影响最大，可溶性淀粉对雷公藤愈伤组织的增长量影响最小，其增长量仅为蔗糖的59%。雷公藤内酯醇含量和产量以麦芽糖作为碳源时最高，其中雷公藤内酯醇含量为蔗糖的1.7倍。总生物碱含量和产量以葡萄糖最高，为蔗糖的1.3倍，但单纯使用葡萄糖时愈伤组织增长量为蔗糖的78%，雷公藤内酯醇产量仅为蔗糖的64%[11]。用15 g/L、30 g/L、45 g/L、60 g/L的蔗糖浓度梯度培养苜蓿愈伤组织，其异黄酮含量与蔗糖浓度呈正相关，说明糖浓度影响异黄酮的积累[12]。

3 氮源

氮源对愈伤组织中次生代谢产物的积累也有很大的影响。在组织培养中，通常采用一定量的混合硝酸盐和铵盐作为氮源，二者单独使用对愈伤组织的生长和次级代谢产物的积累是不利的，印度楝愈伤组织培养基中加入KNO3或尿素时，印楝素的含量较低，当使用NH4NO3作为氮源时，印楝素的含量明显增加[9]。在Rheum ribes愈伤组织培养基中加入不同比例的铵盐和硝酸盐，结果发现，当二者比例为1∶1时，总蒽醌产量达到最大为100%，远远高于那些只加铵盐或是硝酸盐的对照组[13]。

培养基中铵盐和硝酸盐的比例对次生代谢产物的类型和数量有显著的影响[14]。（1）高硝酸盐促进合成。铵盐和硝酸盐的比例对雪莲愈伤组织中棕矢车菊素的含量积累有很大的影响，愈伤组织的生长和棕矢车菊素的积累随硝酸盐浓度的升高而改善或增加，随铵盐的浓度升高而减缓或降低，最适合细胞生长和棕矢车菊素积累培养基是含NH4+-NO3

-的摩尔比是1∶5和1∶2的MS培养基[15]。（2）低硝酸盐促进合成。Nakagawa等[16]也指出，高比例的铵盐和硝酸盐，能增加亚欧唐松草愈伤组织中黄连素的产量，当NH4Cl和KNO3的比例为2∶1的时候，黄连素的产量达到最大12.1 DY。

为了促进植物次生代谢的合成量，去除硝酸盐和铵盐也是有效途径。在金盏菊愈伤组织中，铵盐和硝酸盐的添加比例影响类红萝卜素的生物合成，在半固体培养基中减少铵盐的浓度，增加硝酸盐的浓度，类红萝卜素的诱导率明显增加，当培养基中的铵盐含量为0时，类红萝卜素的诱导率达到最大，为76.77%，当愈伤组织在含有全浓度铵盐的培养基中培养时，类红萝卜素的生成量可忽略不计。因此，通过改变铵盐和硝酸盐的相对含量来提高类红萝卜素的积累是可行的[17]。

4 氨基酸

氨基酸也是影响愈伤组织生物量的一种很重要的因素，不同的氨基酸对同种物质的积累有不同的作用。添加氨基酸能提高益母草悬浮愈伤组织中生物碱的积累量，使用普通培养基培养16 d，愈伤组织中的生物碱积累量达到最大为0.081%，把乳白蛋白水解物或L-脯氨酸加入MS液体培养基中，考察对生物碱含量的影响。结果表明，低浓度的L-脯氨酸能增加生物量和生物碱的积累，而且可以使生物碱的浓度达到2.1%。当增加L-脯氨酸的浓度到0.03 mg/mL时，生物量和生物碱的积累都减少，表明低浓度促进，高浓度抑制。然而，乳白蛋白水解物对生物量或是生物碱的积累都没有明显的作用[18]。

黄酮类化合物是天胡荽的主要组成成分，选择合适的前体氨基酸类物质能提高天胡荽中黄酮类化合物的含量，不同的氨基酸具有不同的效果。数据显示，4 mg/L的吡咯氨酸可以诱导天胡荽愈伤组织产生最大量的黄酮类化合物，干重产量为（10.77 ± 0.25） mg/g，而增加吡咯氨酸的浓度，对黄酮类化合物的积累却无显著的影响，不能使其产量增加。促进天胡荽愈伤组织产生黄酮类化合物的最适谷氨酰胺量为1 mg/L，此时黄酮类化合物的产量达到干重的（10.59 ± 0.18）mg/g，与对照组相比，添加2 mg/ L和3 mg/ L谷氨酰胺对黄酮类化合物的积累无显著差异。苯丙氨酸可以有效地诱导黄酮类化合物的产生，与对照组相比增加了23%。柚皮素是黄酮合成前期的产物，因此也被作为另一类黄酮化合物前体，当愈伤组织中加入4 mg/L柚皮素时，可以获得最大量的黄酮类化合物，而当柚皮素的浓度增加到54 mg/L时，黄酮类化合物的产量有所下降[19]。

5 展望

自20世纪中叶以来，利用植物细胞培养技术生产次生代谢产物的研究取得了快速的发展，如今已是一项非常成熟的现代科研技术。迄今为止，全球已有近千种植物被用于细胞组织培养方面的研究，次生代谢产物含量超过原植物1%的种类有20种以上，含量超过或等于原植物水平的约有50种。多种药用植物通过利用愈伤组织合成次生代谢产物以达到了商业化生产水平。

尽管利用愈伤组织获得次生代谢产物是一种快速、有效的组织培养方法，但是，此种方法影响因素较多，包括外植体种属、生理状态、培养条件、培养方法等内、外因素。不同材料培养的成愈效果差异很大，光照、温度等物理因素和培养基成分等化学因素对次生代谢产物积累量也具有明显的影响。因此，人们在调控植物次生代谢生产有效化合物的研究中，需要经过长时间的探索。

随着药用植物市场需求的增大，野生植物资源逐年减少，部分药用植物人工栽培需要的投入较大、周期较长，利用愈伤组织获得次生代谢产物是目前解决供不应求最为行之有效的方法。通过查阅近几年的国内外文献，综述了营养因子对药用植物愈伤组织中次生代谢产物积累的影响，为进一步研究提供参考。

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（责任编辑：刘俊华）

Infl uence on medicinal plants secondary metabolites accumulation of nutritional factors

ZHANG Le1, ZHU Hong1,2, FANG Huiyong3, ZHANG Chunhong1, LI Minhui1,2
(1. Baotou Medical College, Baotou 014060, China; 2. Inner Mongolia Research Center of Characteristic Medicinal Plants Cultivation and Protection Engineering Technology, Baotou 014060, China; 3. College of Traditional Chinese Medicine of Hebei University, Baoding 071000, China)

Plant secondary metabolites are non-essential compounds with the function of cell life activities and normal operation of growth and development, which are produced by secondary metabolism. The effective components of medicinal plant are usually the plant secondary metabolites. With the increase of medicinal plant market demand, wild plant reduced year by year, getting secondary metabolites from callus is the most effective way to solve the short supply situation. In this paper, through consulting the literatures at home and abroad in recent years, the nutritional factors on accumulation of secondary metabolites in medicinal plant callus are reviewed to provide a basis for further study and development.

neurotrophic factor; medicinal plant; callus; secondary metabolites

10.3969/j.issn.1674-490X.2015.04.010

R287

A

1674-490X(2015)04-0038-04

本文引用：张乐, 朱虹, 房慧勇, 等. 营养因子对药用植物愈伤组织中次生代谢产物积累的影响[J].医学研究与教育, 2015, 32(3): 38-43.

2015-06-05

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAI28B02）；包头市科技计划项目（2013X2001）；中医药行业科研专项（201407003）

张乐（1990—）, 男，内蒙古赤峰人，在读硕士，主要从事蒙药分子鉴定与资源保护。E-mail: 404074256@qq. com

李旻辉（1978—），男，北京人，教授，博士，博士生导师，主要从事药用植物资源利用与保护。E-mail: li_minhui@aliyun. com