实现人类心肌的再生：干细胞的风雨路

瞿海龙，梁 璐，边剑飞，张 冰

（河北大学附属医院急诊科，河北 保定 071000）

实现人类心肌的再生：干细胞的风雨路

瞿海龙，梁 璐，边剑飞，张 冰

（河北大学附属医院急诊科，河北 保定 071000）

如何实现人类心肌的再生，科研工作者和临床医生已经为之努力了近一个世纪。1953年，实施了第一例室间隔缺损修复手术，1967年第一例心脏移植成功，2002年骨髓来源的细胞首次移植到心肌内，使心肌的修复取得重大进步。然而慢性心力衰竭仍是世界范围内的难题。为什么实现心肌的再生面临巨大的挑战？要实现心肌的再生还有多远？细胞移植技术近年已取得突飞猛进的进步，许多大型动物实验结果带来了曙光和挑战。将对心肌再生的历史和临床研究进行探讨，对干细胞的实施和目前正在进行的实验进行综述。

再生医学；干细胞；心肌

心肌梗死后心肌收缩不协调，纤维组织增生，心输出量减少。由于心脏为终末再生器官，不能实现心肌的有效再生，往往导致心力衰竭的发生，而心力衰竭的5年存活率仅为50%[1]。目前针对心力衰竭的治疗主要是药物缓解症状，只有不到0.1%的患者接受心脏移植。心肌梗死导致的缺血性心肌病是患者死亡和丧失劳动能力的主要原因[2]。

近年实现心肌的再生已由一个模糊的概念发展到科学研究的前沿，成为多学科共同努力的目标。修复受损心肌包括细胞移植、基因治疗、刺激内源性修复途径、细胞重组、心肌组织工程和生物材料的应用，其中最有希望的策略是外源性细胞的移植。从骨骼肌成纤维细胞到多潜能干细胞，几乎能够想到的细胞均用于了受损心肌的修复。这是一个令临床医生、科学家和工程师兴奋而又具有挑战的时代，动物实验实现心肌的再生已取得可喜的成绩，如何将其成功用于临床，已成为目前研究的热点。

一次心肌梗死后大约有10亿心肌细胞丢失，而成体心脏再生能力有限，受损的心肌只能由纤维组织所替代。外源性细胞移植通过旁分泌效应或再生心肌实现心脏的有效收缩，骨骼肌成纤维细胞、骨髓源性造血干细胞、间充质干细胞、脂肪源性细胞、内皮祖细胞、心肌源性细胞均用于临床研究。一种理想的能够替代受损心肌组织的细胞需具有收缩性和电生理特性，能够在缺血心肌内存活、整合到心肌内、实现有效的增殖，并能够通过旁分泌刺激内源性的再生[3]。尽管目前用于临床研究的细胞种类很多，还没有一种细胞能够满足以上所有要求。由于细胞移植的途径、移植的时机差异，以及自体或异体细胞不同，使不同实验间很难进行比较，各类细胞的疗效判断较为困难。

1 骨髓来源的细胞

在骨骼肌成纤维细胞临床实验之后，骨髓来源的细胞受到科研工作者的大力推崇，将其通过冠脉途径移植到心脏。尽管在其应用于临床之前，并没有公开证据证明其具有心肌再生作用[4]。

1.1 骨髓来源的单个核细胞

大多数临床试验中应用的骨髓源细胞为未分离纯化的细胞群，被称作骨髓单个核细胞（bone marrowmononuclear cells，BMMNCs）。将BMMNCs称作干细胞是一种误称，因为在所有的单核细胞内干细胞不到0.1%。未分离的BMMNCs主要由非均质造血细胞组成，包括单核细胞、定向髓系祖细胞、淋巴细胞，还有一小部分造血干细胞和间充质干细胞[5]。

2002年首次报道将BMMNCs用于治疗心肌梗死的患者[4]，然而该实验被称违背了伦理学，在其随后的研究更加严格认真。大多数早期BMMNCs的研究将ST段抬高、射血分数40%～50%的心肌梗死纳入研究对象，结果显示射血分数增加。一项研究[6]显示，将自体BMMNCs经冠脉途径移植到梗死相关动脉，实验组无不良事件发生，6个月时核磁显像示左室射血分数明显提高，为BMMNCs移植提高心肌梗死患者的收缩功能提供了依据。长期追踪研究显示，这种细胞移植带来的效益并不会持续很久[7]。另一项研究进一步支持了BMMNCs的效益， BMMNCs移植组射血分数在4个月时提高了5.5%，而对照组的射血分数提高了3%。遗憾的是该研究是应用左室造影评价心功能，而不是心肌核磁显像[8]。该研究小组在随后的研究发现，与静脉血液中的祖细胞相比，BMMNCs移植组其改善左室功能的作用可持续5年之久[9]。

尽管这些研究显示BMMNCs移植可提高心功能，随后的大规模随机、安慰剂对照和双盲实验并未重复出这些结果。心血管疾病细胞治疗研究网（the Cardiovascular Cell Therapy Research Network，CCTRN）在美国发起一项细胞治疗实验，FOCUS-CCTRN研究。该实验首次将心肌梗死后不宜行血管成形术的慢性心力衰竭患者纳入研究对象，这些患者的射血分数为30%～32%，心功能2～3级。早期终点结果显示，左室收缩末容积和最大心肌耗氧量没有显著差异，在6个月时细胞移植组的射血分数较基线增高1.4%[10]。CCTRN也发起了另一项实验，称作TIME和晚TIME实验，用于评估BMMNCs移植时机对左室功能的影响[11]。该实验为随机双盲、安慰剂对照，纳入患者均为成功再灌注的心肌梗死患者，分别在梗死后3～7 d（TIME组）或者2～3周（晚TIME组）将自身BMMNCs经冠脉途径移植到心脏。实验发现无论是TIME组还是晚TIME实验组，在6个月时经心肌核磁显像检查，没有任何左室功能的改善。随后的一项SWISS-AMI实验，采取相同的实验设计，相同数量的细胞，用于比较5～7 d细胞移植与3～4周细胞移植的差异，在4个月时同样并未发现任何一组心功能有所改善[12]。这些实验结果与最初的实验结果截然不同，其原因考虑为后期实验均采取随机双盲研究，且后期纳入实验患者的心功能都比较差。目前在欧洲正进行一项由3 000名患者参与的3期临床试验，希望该实验结果能够解决这些相互冲突的临床结果。

1.2 间充质干细胞

多数实验应用的间充质细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是由骨髓当中提取的，此类细胞具有向成骨细胞、软骨细胞和脂肪组织分化的特点[13]。骨髓当中的MSCs不到0.01%，因此要满足临床的需要需体外扩增培养。

首例临床实验将MSCs经冠脉途径移植到心肌梗死患者体内，在3个月后发现左室射血分数提高，心肌血流灌注增加[14]。一些研究直接比较BMMNCs与MSCs的安全性与有效性，其中包括TAC-HFT实验。该实验将BMMNCs或MSCs经心肌内膜下注射到慢性心肌梗死患者体内，两组患者1年后恶性事件发生率和左室射血分数无明显差异。通过应力学分析，MSCs移植组局部室壁运动能力得到提高[15]。然而这些研究应用的MSCs均为自体的，从MSCs提取到临床应用，需很长时间体外培养与扩增。随后的POSEIDON实验对自体MSCs与异体MSCs的安全性和有效性进行评估。该研究应用心导管技术，将不同剂量的MSCs（20，100或200百万）注射到慢性心肌梗死患者的心肌内，结果显示无论是自体MSCs还是异体MSCs，均无明显免疫排斥反应。有趣的是患者的射血分数和左室重构与细胞移植的数量呈负相关，即20百万细胞移植组比200百万移植组其心功能改善更明显[16]。

上述实验均是对“纯天然”的MSCs进行研究，C-CURE实验采取了一种非常独特的方法，在移植自身MSCs之前，先对其进行鸡尾酒处理。应用NOGA电标，将这些细胞移植到心肌梗死后慢性心力衰竭患者的心肌内，这些患者接受治疗的时间为平均心肌梗死后1540 d。与对照组相比，移植组的左室射血分数提高了7%，心脏运动能力显著提高[17]。MSC移植能够改善心功能，其机制目前尚不清楚。MSCs进入体内1周或2周后心肌分化数量极少，其转分化机制起主导作用的可能性不大，动物实验表明更有可能是旁分泌效应起到的作用。

尽管MSCs治疗心肌疾患的安全性与有效性在1期临床实验得到验证，然而有研究显示MSCs除可适度缩小心肌梗死面积外，对左室收缩功能的影响甚微，因为MSCs移植到心脏后在几周内迅速死亡，且并没有确切的证据证明其有心肌分化能力，所有的临床效益可能来源于旁分泌[18]。关于MSCs旁分泌效益在体内持续时间尚无确切结论，已有研究显示其在1年时对心肌梗死患者仍存在有益作用[15]。

2 心肌来源干细胞

目前最引人关注的临床实验是心肌来源的干细胞（cardiac-derived cells，CDCs），通过心肌活检获取标本，在体外培养获得CDCs。在啮齿类动物实验中发现，CDCs是一类比BMMNCs和MSCs更有潜能的一类细胞[19]。最初认为CDCs是心肌祖细胞，然而现在大多数研究者认为，CDCs类似于骨髓细胞，其心肌分化潜能差，主要是通过旁分泌效应起到作用。目前应用CDCs的临床实验主要有 3 项。

2.1 SCIPIO实验

该实验纳入了33例慢性心肌梗死后心力衰竭的患者，平均基线射血分数为27.5%。行冠脉搭桥手术时从其右心耳检取标本，应用标本体外提取c-kit阳性、造血细胞和心血管细胞标志物阴性的干细胞。通过4个月的体外培养，将0.5～1百万的CDCs通过冠脉移植到缺血心肌内，其中20例患者接受了此项治疗，13例患者作为对照。在移植后4个月和12个月时，应用心脏超声或心肌核磁显像对患者的心功能进行评价。结果显示，4个月时患者的射血分数提高了8.2%，12个月时射血分数提高了12.3%，而且亚组分析显示，移植组梗死面积缩小[20]。

2.2 CADUCEUS实验

在CADUCEUS 1期临床实验中，纳入的患者为心肌梗死后2～4周实施血管成形术、射血分数为39%的病人。从这些患者的右室活检心肌组织，在体外扩增培养1～3个月。25百万的CDCs经冠脉途径移植到梗死相关的冠状动脉。实验结果显示，早期终点是安全的，心肌核磁显像提示在移植6个月和12个月时，梗死心肌面积减少，有功能的心肌细胞数量增加。尽管实验未发现左室射血分数显著改善，但局部室壁运动明显加强，此效应从移植后4个月显示，一直持续1年[21]。研究者认为，有功能的心肌细胞数量增加，是由于心肌细胞的再生的结果，然而并不能除外原来心肌的病理性肥大。实验发现，细胞移植组在1年时有较高的室速和恶性事件发生率，虽然与对照组无统计学差异，但仍需在随后的研究中引起高度关注。

2.3 ALCADIA实验

该实验目前正在实施过程中，首次将细胞因子与细胞治疗结合起来。实验纳入射血分数为15%～45%、心功能3级或4级患者，早期终点为1年，评估实验安全性。第二终点为6个月时应用超声或核磁显像评估患者心功能。当患者实施冠脉搭桥手术时，将自体的CD105+/CD90+CDCs注射到患者心肌内，随即在注射部位植入带有成纤维细胞生长因子的生物降解胶板。尽管目前只纳入了6 例患者，但早期结果显示移植组射血分数明显提高，梗死面积缩小，而且提高了患者的有氧运动耐量。

从以上实验结果来看，CDCs移植展现出了一些优于骨髓来源的细胞特性。由于CDCs需体外长期培养，心肌梗死后1～4个月后才能实施细胞移植，此时梗死区炎症反应减退，更适于细胞存活。

3 多潜能干细胞

到目前为止，干细胞移植实现心肌再生的临床实验并未取得预期结果，是否有一种更加潜能的细胞可用于移植到心脏呢？自第 1 例小鼠胚胎干细胞实现心肌有效再生之后，人类多潜能干细胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）的研究进入了一个新的历史阶段。目前已制订出诱导hPSCs 心肌分化的守则[22]，这使其成为下一个最有前途的细胞资源，许多动物实验已将其用于心肌的再生。hPSCs移植多采用心肌内注射的方法，实验结果显示移植组心功能得到改善[23]。

移植到心肌的细胞，首先需与宿主细胞实现电的偶联，这是实现同步收缩的必要条件。荧光钙信使蛋白GCaMP3是实现这种偶联的有效标志物。将基因修饰的人胚胎干细胞（human embryonic stem cell，hESC)移植到受损的小鼠心肌内，发现hESC分化为心肌细胞，且表达GCaMP3，表明hESC源性心肌细胞与小鼠的心肌细胞实现了有效电偶联[24]。

尽管对hPSC源性心肌细胞的研究取得了很大进步，但要将其应用于临床还有许多待解决问题。首先，hPSC移植后在体内存活率非常低。虽然移植前都常规对这些细胞进行“预存活”处理，但其在体内要实现长期停留、存活还是很困难的。随着生物工程的进步，移植细胞补片、心外膜补片可能会成为解决此类问题的有效方法。第二，hPSC源性心肌细胞移植时机问题。有研究[25]认为，中度成熟的hPSC最适合于移植，因为成熟的hPSC在体内不能存活，而未成熟的hPSC有自动节律性、缓慢收缩性，可导致心律失常。急性心肌梗死早期由于局部炎性反应强烈，干细胞移植后可迅速发生坏死、凋亡，因此hPSC移植应于心肌梗死后3~5 d实施较为适宜。第三，伦理学问题。这也是阻碍hPSC实际应用的主要问题，从hPSC的获得到定向诱导分化，都要无可避免地面对医学伦理问题。

总之，在过去的几十年里，心肌的再生取得了巨大的进步。尽管成功实现人类心脏的再生面临着很多挑战，但相信其将会成为一条崭新的治疗途径。

[1] GO A S, MOZAFFARIAN D, ROGER V L, et al. Heart disease and stroke statistics--2013 update: a report from the American Heart Association[J]. Circulation, 2013, 127(1): e6-e245.

[2] LOZANO R, NAGHAVI M, FOREMAN K, et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010[J]. Lancet, 2013, 381(9867): 628.

[3] FUTAKUCHI-TSUCHIDA A, MURRY C E. Human myocardial grafts: do they meet all the criteria for true heart regeneration? [J] Future Cardiol, 2013, 9(2): 151-154.

[4] STRAUER BE, BREHM M, ZEUS T, et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans[J]. Circulation, 2002, 106(15): 1913-1918.

[5] MALLIARAS K, MARBA/N E. Cardiac cell therapy: where we've been, where we are, and where we should be headed[J]. Br Med Bull, 2011，98(1): 161-185.

[6] WOLLERT K C, MEYER G P, LOTZ J. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial[J]. Lancet, 2004, 364(9429): 141-148.

[7] MEYER G P, WOLLERT K C, LOTZ J, et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial[J]. Circulation, 2006, 113(10): 1287-1294.

[8] SCHA CHINGER V, ERBS S, ELSASSER A, et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction[J]. N Engl J Med, 2006, 355(12): 1210-1221.

[9] LEISTNER D M, FISCHER-RASOKAT U, HONOLD J, et al. Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI): final 5-year results suggest long-term safety and efficacy[J]. Clin Res Cardiol, 2011, 100(10): 925-934.

[10] PERIN E C, WILLERSON J T, PEPINE C J, et al. Effect of transendocardial delivery of autologous bone marrow mononuclear cells on functional capacity, left ventricular function, and perfusion in chronic heart failure: the FOCUS-CCTRN trial[J]. JAMA, 2012 , 307(16): 1717-1726.

[11] TRAVERSE J H, HENRY T D, VAUGHAN D E, et al. LateTIME: a phase-II, randomized, double-blinded, placebo-controlled, pilot trial evaluating the safety and effect of administration of bone marrow mononuclear cells 2 to 3 weeks after acute myocardial infarction[J]. Tex Heart Inst J, 2011, 37(4): 412-420.

[12] SURDER D, MANKA R, Lo CICERO V, et al. Intracoronary injection of bone marrow-derived mononuclear cells early or late after acute myocardial infarction: effects on global left ventricular function[J]. Circulation, 2013, 127(19): 1968-1979.

[13] 瞿海龙, 麻月云, 边剑飞. 干细胞治疗心脏疾患研究进展[J]. 医学研究与教育, 2014, 31(5): 55-58.

[14] CHEN S L, FANG W W, YE F, et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrowmesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction[J]. Am J Cardiol, 2004, 94(1): 92-95.

[15] HELDMAN A W, DIFEDE D L, FISHMAN J E, et al. Transendocardial mesenchymal stem cells and mononuclear bone marrow cells for ischemic cardiomyopathy: the TAC-HFT randomized trial[J]. JAMA , 2014, 311(1): 62-73.

[16] HARE J M, FISHMAN J E, GERSTENBLITH G, et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial[J]. JAMA, 2012, 308(22): 2369-2379.

[17] BARTUNEK J, BEHFAR A, DOLATABADI D, et al. Cardiopoietic stem cell therapy in heart failure: the C-CURE (Cardiopoietic stem Cell therapy in heart failure) multicenter randomized trial with lineage-specified biologics[J]. J Am Coll Cardiol, 2013, 61(23): 2329-2338.

[18] 瞿海龙, 麻晓静, 张冰, 等. 干细胞在心肌再生中的研究进展[J]. 医学研究与教育, 2011, 28(4): 62-64.

[19] LI T S, CHENG K, MALLIARAS K, et al. Direct comparison of different stem cell types and subpopulations reveals superior paracrine potency and myocardial repair efficacy with cardiosphere-derived cells[J]. J Am Coll Cardiol, 2012 , 59(10): 942-953.

[20] BOLLI R, CHUGH A R, D'AMARIO D, et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial[J]. Lancet, 2011, 378(9806): 1847-1857.

[21] MALLIARAS K, MAKKAR R R, SMITH R R, et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells after myocardial infarction: evidence of therapeutic regeneration in the final 1-year results of the CADUCEUS trial (Cardiosphere-Derived autologous stem cells to reverse ventricular dysfunction) [J]. J Am Coll Cardiol, 2014, 63(2): 110-122.

[22] BURRIDGE P W, KELLER G, GOLD J D, et al. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming[J]. Cell Stem Cell, 2012, 10(1): 16-28.

[23] MAHER K O, XU Chunhui. Marching towards regenerative cardiac therapy with human pluripotent stem cells[J]. Discov Med, 2013, 15(85): 349-356.

[24] SHIBA Y, FILICE D, FERNANDES S, et al. Electrical Integration of Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in a Guinea Pig Chronic Infarct Model[J]. J Cardiovasc Pharmacol Ther, 2014, 19(4): 368-381.

[25] CHONG J J, YANG X, DON C W, et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts[J]. Nature, 2014, 510(7504): 273-277.

（责任编辑：刘俊华）

The hard road to regenerating the human heart

JU Hailong，LIANG Lu，BIAN Jianfei，ZHANG Bing
（Emergency Department, Affi liated Hospital of Hebei University, Baoding 071000，China)

Regenerating the human heart is a challenge that has engaged researchers and clinicians around the globe for nearly a century. From the repair of the fi rst septal defect in 1953, followed by the fi rst successful heart transplant in 1967, and later to the fi rst infusion of bone marrow-derived cells to the human myocardium in 2002, signifi cant progress has been made in heart repair. However, chronic heart failure remains a leading pathological burden worldwide. Why has regenerating the human heart been such a challenge, and how close are we to achieve clinically relevant regeneration? Exciting progress has been made to establish cell transplantation techniques in recent years, and new preclinical studies in large animal models have shed light on the promises and challenges that lie ahead. In this review, we will discuss the history of cell therapy approaches and provide an overview of clinical trials using cell transplantation for heart regeneration. Focusing on the delivery of human stem cell derived cardiomyocytes, current experimental strategies in the fi eld will be discussed as well as their clinical translation potential.

regenerative medicine; stem cells; myocardium

10.3969/j.issn.1674-490X.2015.04.012

R542.2

A

1674-490X(2015)04-0050-06

本文引用：瞿海龙, 梁璐, 边剑飞, 等. 实现人类心肌的再生：干细胞的风雨路[J]. 医学研究与教育, 2015, 32(4): 50-55.

2015-06-13

瞿海龙（1976—）, 男，河北涞水人，副主任医师，硕士，主要从事急救医学临床和科研。E-mail: hailongju1976@sina.com