骨形态发生蛋白-9诱导牙周膜干细胞成骨分化及信号通路的研究进展

汪 沛综述，曹志中审校

0 引 言

牙周病是一种破坏牙周支持组织，导致牙周附着丧失的慢性炎症破坏性疾病，是国内外公认口腔失牙的主要原因［1-2］。由于严重影响人类生活质量甚至全身健康，且传统方法只能抑制疾病进展无法恢复牙周组织功能，所以牙周病治疗的新方法一直为口腔学者研究的热点。近年来，牙周组织工程治疗牙周病的方案被初步证明具有一定效果，这是以根治牙周病并恢复牙周组织功能为目的的新方法、新思路［2-3］。

牙周组织工程治疗牙周病的重点在于恢复牙周组织的形态与功能，其中骨再生是关键［2-3］。近年来，牙周组织工程中被誉为最强成骨生长因子——骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins-9，BMP9)和最佳种子细胞——牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)相继被证实和发现。进一步研究表明其诱导成骨分化途径主要包含BMP-Smad蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic proteins，Smads)和BMP-丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)2 条信号通路，并且在2条信号通路的下游发现参与干细胞成骨分化的重要因子——Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)和成骨细胞特异性转录因子(Ostereix，Osx)活性显著增强，同时表达大量成骨特异性标志物，细胞逐渐成骨分化［4-8］。这些研究对彻底治疗牙周疾病、恢复牙槽骨的形态与功能、以及阐明成骨原因、控制成骨分化的时机等有着重要的临床和科研意义。本文就BMP9对PDLSCs在骨分化中的作用和功能的影响以及信号通路方面的最新研究进展进行综述。

1 牙周组织工程中BMP9 对PDLSCs成骨分化的影响

1.1 PDLSCs是牙周组织工程中最佳种子细胞PDLSCs是具有低免疫原性和多向分化潜能的异质性多能干细胞，可以向成纤维细胞、成骨细胞、破骨细胞和成牙骨质细胞等牙周膜主要细胞分化，进而形成牙周膜和牙槽骨，最后形成新的牙周附着结构修复牙周缺损［2］。学者们在建立牙槽骨缺损动物模型后，利用PDLSCs作为种子细胞的牙周组织工程复合材料修复实验动物的牙槽缺损，证实添加PDLSCs的复合材料可显著增强牙周组织的形成和修复能力［9-10］。在成骨效率方面，学者们比较了PDLSCs、骨髓间充质干细胞、牙髓干细胞和牙龈成纤维细胞4种牙周组织工程潜在种子细胞的骨修复效果，结果显示PDLSCs表现出更强的碱性磷酸酶活性与钙盐沉积能力，这表明PDLSCs成骨能力要强于后两者，并且PDLSCs还具有形成牙骨质样结构的能力，可以更好地进行牙周组织修复，使得PDLSCs成为学者们在牙周组织工程的首选种子细胞［11-13］。

1.2 BMP9是牙周组织工程中合适的成骨生长因子 BMPs作为组织工程中多功能生长因子，其家族成员除BMP1以外均属于转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族，该蛋白是可溶活性糖蛋白，一般以二聚体形式行使生物学功能。体内外研究均证实，BMPs具有骨诱导作用，可参与骨骼生长、发育和创伤修复等过程［14-15］。该蛋白其家族虽包含众多成员，但成骨的效果和能力存在差异，Kang等［14］在系统分析了已知的BMP2-15的14种BMPs成骨能力后，认为BMP9相对于其他BMPs具有更强的骨诱导能力，更适合作为组织工程中成骨分化方面的首选生长因子。BMP9又称为生长分化因子-2，由肝合成分泌并通过血液循环到达全身其他部位发挥生物学功能［16］。结构上，二聚体BMP9由2个单体在C末端通过3对二硫键连接组成1个半胱氨酸结节的核心支架，每个单体的N端大臂再从该半胱氨酸核心以β折叠展开，最后形成类似蝴蝶样构型的整体。BMP9与家族其他成员在结构上的差异主要表现为前螺旋大臂上的残基和结合界面上的氨基酸不同，此差异是其区别于家族其他成员在受体结合种类与效率上区别的主要原因，也是BMP9高效诱导成骨的重要原因之一［16］。

1.3 BMP9诱导PDLSCs成骨分化产生成骨标志物 在生长因子的调控下，干细胞成骨分化并形成矿化成熟的骨基质主要包括以下阶段［17］:①成骨分化的干细胞在增殖晚期，下调细胞周期与增殖的相关基因使细胞增殖减缓，细胞由增殖期进入分化期并开始成骨分化。分化早期细胞会分泌碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和钙盐结晶体至细胞外基质中，ALP可以水解有机磷酸酶，导致PO43-局部升高，从而对钙化抑制剂产生破坏，启动钙化过程。②在细胞外基质成熟期，Ⅰ型胶原(TypeⅠcollagen，col-Ⅰ)合成并相互交联、成熟并进入矿化期。矿化期细胞内的ALP活性减弱，而与细胞外基质中羟磷灰石沉积相关的基因表达上调并翻译产生包括骨桥蛋白 (osteopontin，OPN)、骨钙蛋白 (osteoclain，OCN)、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)等重要成骨蛋白。③OCN等非胶原蛋白分泌至细胞外基质中，沿胶原蛋白的长轴与Ca2+、P3+结合到胶原分子侧链的胶原氨基酸残基上，形成羟磷灰石结晶，最后通过骨改建形成具有生理功能的骨组织［17］。Ye等［4］报道，通过重组BMP9腺病毒载体感染体外培养的 PDLSCs后，细胞表达的 ALP、col-Ⅰ、BSP、OPN、OCN等成骨分化标志物分别在细胞成骨分化的早、中、晚期相对空白腺病毒对照组明显升高，并且在细胞成骨分化的晚期出现钙盐沉积，这表明BMP9对PDLSCs具有较强的诱导成骨分化能力。

2 BMP-Smads信号通路和BMP-MAPK信号通路

2.1 BMP特异性受体(bone morphogenetic protein receptor，BMPR)BMPR是指在干细胞膜上具有Ser/Thr蛋白激酶活性的跨膜受体，该受体以二聚体行使功能。BMPR可分为BMP特异性Ⅰ型受体(BMPR-Ⅰ)和BMP特异性Ⅱ型受体 (BMPR-Ⅱ)2 类［15，18］。BMPR-Ⅰ家族包含 ALK1-7 共7 个成员，但Luo等［19］研究证明仅ALK1与ALK2突变将严重影响BMP9的成骨功能，进一步研究发现ALK1和ALK2与BMP9的氨基酸片段存在互补，证实ALK1和ALK2在BMP9诱导成骨分化中发挥重要作用。另有实验证明 BMPR-Ⅱ家族 4个成员(TGFβRⅡ、BMPRⅡ、ActRⅡ、ActRⅡB)中仅 BMPRⅡ和ActRⅡ对于BMP9参与成骨分化发挥重要作用，为 BMP9 的特异性受体［20］。结构上，BMPR-Ⅰ为单次跨膜的糖蛋白受体，在BMPR-Ⅰ激酶上游有一个富含Gly和Ser的GS结构域，该结构域中含若干磷酸化位点和一段保守的-Ser-Gly-Ser-Gly-，称为GS序列，为BMPR-Ⅰ特有，并且可被BMPR-Ⅱ磷酸化激活［18］。BMPR-Ⅱ与 BMPR-Ⅰ结构类似，但无GS结构域，是结构活性型受体，通过和配体(BMPs)结合发生自身磷酸化而被激活［18］。BMPR-Ⅰ和BMPR-Ⅱ可形成异二聚体并在BMP信号通路中起重要作用［15，18，21］。

2.2 Smads信号通路参与BMP9诱导PDLSCs成骨分化 BMP9主要是通过经典的BMPs-BMPRSmads信号转导通路传递信号，并发挥诱导成骨分化等生物学功能［5，15］。BMP9 通过与 BMPR-Ⅰ、BMPR-Ⅱ相结合形成异源三聚体使信号进入细胞膜内并磷酸化激活Smads，使Smads家族相关成员行使生物学功能，将信号转移至细胞核内，引起相应的基因转录［19-20，22-24］。

2.2.1 Smad蛋白 Smad蛋白是将 TGF-β 超家族信号从细胞表面传导至细胞核内过程中起着关键作用的信号通路蛋白［18］。目前为止共发现9个亚型，为Smad1-9，按功能不同可分为:受体活化型或通路限制性Smads(R-Smads，BMP9激活的BR-Smads主要为 Smad 1、5)、共同通路型 Smad(Co-Smad，仅有Smad4)和抑制性 Smads(I-Smads，包含 Smad 6、7)［22，24］。结构上，Smads蛋白在 N 末端和 C 末端各有1个高度保守的结构域，分别称为MH1和MH2，两者之间为富含脯氨酸的连接域［5］。MH1结构域约130个氨基酸，只在R-Smads和Co-Smad亚家族间存在并且序列高度保守，都是由4个α螺旋，6个短β折叠和5个环等二级结构组成球状四级结构。在基础状态下，MH1能与MH2相结合，抑制MH2的生物学活性;当 Smads蛋白激活后，可以通过MH1内1个约11个氨基酸组成的β发夹结构特异性结合到DNA的Smad结合元件(Smad-binding element，SBE)上，诱导转录反应［18，25］。MH2 结构域存在于全部Smads中并且序列高度保守，约200个氨基酸，形成β-三明治结构。MH2的功能主要包括与BMPR-Ⅰ相互作用，形成Smads多聚复合物，结合其他转录共激活剂或共抑制剂。此外每个单体Smads蛋白还可以通过MH2相互作用同向叠加组成同聚体，基础状态下MH2也有抑制MH1与DNA结合的作用［18，25］。中央连接区内有多个磷酸化位点，被磷酸化激活后可以抑制Smads蛋白的核转移，是Smads蛋白的负调控区域［25］。

BR-Smads蛋白MH2结构域中C末端还含有Ser-Ser-X-Ser序列(SSXSmotif)的磷酸化位点，可特异性与 BMPR-Ⅰ相互作用并被磷酸化［5，25］。Co-Smad的C端不含该磷酸化位点，不能与BMPR相互作用，但它可以通过MH2上的结合位点与R-Smads或I-Smads相互作用形成有功能的异源三聚体［18］。I-Smads对信号通路发挥负调控作用，在结构上ISmads仅MH2区与家族其他成员具有较大的同源性，其C端缺乏磷酸化位点，也没有保守的MH1功能区。功能上I-Smads与R-Smads竞争性与BMPRI结合，干扰R-Smads与BMPR-Ⅰ结合以及磷酸化，从而抑制信号转导，在BMP9信号通路中发挥负调控作用［25］。

2.2.2 BMP-Smads信号通路 目前，BMP9 通过BMP-Smads信号通路诱导成骨分化已得到学者们普遍认可，该信号通路属于激酶传导系统，被认为是BMPs诱导成骨分化的经典信号通路［18］。在牙周组织工程中，学者们通常利用BMP9重组腺病毒(Ad-BMP9)感染PDLSCs，感染后上调基因并翻译合成BMP9蛋白，该蛋白首先被合成为较大的前体，前体包含信号肽区、前结构区并且在C-末端含有7个保守的半胱氨酸残基。前体的C端区域通过蛋白分解过程释放形成BMP9单体，2个单体再通过二硫键相结合发生二聚，最后形成有活性功能的二聚体并被分泌出来［15］。分泌到细胞外的二聚体BMP-9会结合位于靶细胞膜上同样以二聚体行使功能的BMPR-Ⅱ，与BMP-9结合后的BMPR-Ⅱ自身发生磷酸化而被激活，接着自身活化的BMPR-Ⅱ再磷酸化BMPR-Ⅰ的GS区，从而激活BMPR-Ⅰ，并形成受体复合物［22，25］。激活后的受体复合物作用于 BRSmads的C端的SSXS序列，磷酸化该序列的Ser而激活BR-Smads，2个磷酸化的BR-Smads与Co-Smad结合形成功能性异源三聚体复合物，转移到核中与SBE或环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)等DNA转录因子相互作用，表达产生Runx2和Osx等重要成骨转录因子，诱导细胞成骨分化［22，24］。

2.3 MAPK信号通路参与BMP9诱导PDLSCs成骨分化 MAPK属于Ser/Thr蛋白激酶，分布于细胞胞浆，是通过保守的三级级联反应［MAPKKK-MAPKK-MAPK］将细胞外信号转导至细胞核内的重要信号通路因子，参与调节细胞的迁移、增殖、分化、凋亡等一系列基本生命活动，MAPK主要包括胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)家族、c-Jun N 端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)家族、P38 蛋白激酶(p38MAPK，p38)家族［4，6，26］。早前的实验中已有学者证实p38和ERK1/2参与BMPs家族信号通路，并能促进成骨基因的表达以及活体内骨再生［15，21，26-27］。最近，在牙周组织工程中，Ye 等［13］也已证实BMP9对PDLSCs诱导成骨分化的信号通路包含p38和ERK1/2途径。

2.3.1 P38和BMP-p38信号通路 P38是由360个氨基酸组成的相对分子质量约为38000的蛋白质，属应激激活蛋白酶，在调节细胞分化、炎症、凋亡和应力刺激应答方面发挥重要作用［4，6，26，28］。目前为止，p38家族共发现 4种亚型:p38α，p38β，p38γ(ERK6，SAPK3)和 p38δ (SAPK4)，其中，p38α 和p38β表达在所有组织器官中，而p38γ和p38δ只表达于特定组织器官［26］。Greenblatt等［27］利用小鼠活体实验，敲除 MKK3，MKK6，p38α，p38β 后发现小鼠成骨缺陷，并且发现MKKK家族成员TGF-β-激活激酶1(TGF-β-activated kinase1，TAK1)是 p38促进成骨分化关键的上游因子，并认为 TAK1-MKK3/6-p38-Runx2是维持骨发生与骨平衡的重要通路。Ye等［4］通过 BMP-9重组腺病毒(Ad-BMP9)感染PDLSCs后发现p38与MKK3/6总蛋白表达均无显著变化，但两者的磷酸化水平明显升高，这说明BMP9作用下MKK3/6-p38信号通路被激活。后续实验中，Ye等［4］发现在加入p38抑制剂后的第7-21天，ALP、OPN、OCN等的基因及蛋白表达水平和钙盐沉积量均有不同程度的下降，证明p38MAPK信号通路在BMP9诱导PDLSCs成骨分化过程中起重要作用。

目前BMP-9诱导PDLSCs成骨分化的p38信号通路尚不完全清楚，根据现有的研究结果学者们普遍认可如下观点:BMP-9激活BMPR并与之相互作用形成受体复合物，激活后的BMPR通过TAK1衔接蛋白1与TAK1间接结合，磷酸化激活 TAK1，TAK1再激活并磷酸化MKK3/6，MKK3/6可以激活并磷酸化p38α/β，p38被激活后进入细胞核磷酸化激活Runx2，并与之协同共激活CREB结合蛋白上调相关成骨基因表达，诱导细胞成骨分化［5-7，26］。

2.3.2 ERK1/2和 BMP-ERK1/2信号通路 人类ERK1/2包括含379个氨基酸相对分子质量为44000的ERK1和含360个氨基酸相对分子质量为42000的ERK2的2种异构体，其同源性超过80%，两者功能相似，在所有组织都有不同程度表达［6］。ERK1/2可在胞质内调节其他基因表达，也可以进入细胞核促进某些基因转录和表达，与细胞增殖和分化密切相关［4，6，21，23］。由 ERK1/2 参与传递信号的通路为经典MAPK信号通路，可被生长因子、细胞因子、病毒、癌基因等多种刺激激活［33］。在牙周组织工程领域，包括应力刺激、电磁场、生长因子等诱导种子细胞成骨分化的研究中均发现有ERK1/2通路参与其中并发挥重要作用［4，6，21，29-30］。Ye 等［4］在BMP9诱导PDLSCs成骨分化的研究中阻断ERK1/2通路后，发现细胞的成骨能力明显下降，证明ERK1/2信号通路在BMP9诱导PDLSCs成骨分化方面发挥重要作用。

ERK1/2通路发现较早，目前研究比较透彻，该通路通过膜结合型的GTP/GDP蛋白——Ras蛋白(又称:大鼠肉瘤蛋白，rat sarcoma，Ras)、MAPKKK家族的Raf蛋白激酶和MAPKK家族的MAPK-ERK激酶 1/2(MAP kinase-ERK kinase1/2，MEK1/2)以及ERK1/2传递信号。当BMP-9作用于细胞膜后会激活BMPR并形成激活的受体复合物，将信号由胞外传递至胞内的同时使小分子鸟苷酸结合蛋白Ras的 GDP 解离而结合 GTP，激活 Ras［6］。激活的Ras发生膜转位并与丝/苏氨酸蛋白激酶Raf的氨基端结合，激活Raf。Raf蛋白是蛋白质酪氨酸激酶受体信号传导的中心，具有Ser/Thr蛋白激酶活性，可磷酸化 MEK1/2的 Ser/Thr，从而激活 MEK1/2［6，23］。MEK1/2 为双特异性激酶，可以使 Ser/Thr和Typ发生磷酸化，激活ERK1/2，激活后的ERK1/2转位进入细胞核进而磷酸化激活如Runx2和Osx等成骨转录因子，调控靶基因的转录，诱导细胞成骨分化［4，6，21，23］。

3 BMP9 信号通路下游的成骨转录因子

3.1 Runx2是信号通路下游的重要成骨转录因子Runx是一类由α和β亚单位构成的异二聚体转录因子蛋白的统称，其分子结构特征是包含一段被称为Runt结构域的DNA结合区，该段结合域与果蝇分节基因Runt同源，由128个保守的氨基酸序列组成［31］。Runxs家族成员 Runx2，是一种能够上调多种成骨基因的特异性转录因子，在细胞成骨分化、骨发育方面起重要作用［32］。在结构上Runx2主要包含1个Runt结构域、3个转录激活区(AD)、1个转录抑制区(RD)、1个短的Myc相关核定位信号区(NLS)［31］。Runt结构域可以特异性识别并结合靶基因启动子区的成骨细胞特异性顺式作用元件2，调控靶基因转录。3个转录激活区中，AD1和AD2位于N端，为Runx2所独有，并在核心定位中发挥作用［31-32］。AD3为 Runx2主要激活区，它位于Runx2分子的C端富含Pro、Ser、Thr结构域(PST)的N末端部分，可以与Smads或MAPKs等发生相互作用，RD位于PST结构域C端，起转录抑制作用［31］。在Runt结构域与PST结构域N端连接重合处的9个氨基酸序列，是核定位信号序列(nuclear localization signal，NLS)，作用是帮助亲核蛋白进入细胞核［31，33］。在PST的C端存在一个核基质转导信号结合位点，该区域可被BMP9-Smads复合物或BMP9-MAPK复合物等特异性识别并可将Runx2定位在核内特定区域，调控成骨特异性基因转录，若该区域发生突变，则影响细胞成骨分化以及骨发育缺陷［33］。多项研究表明BMP9作为Runx2的上游调控因子，可以通过Smad信号通路和MAPK信号通路使 Runx2基因表达上调，或直接磷酸化激活Runx2蛋白，调控相关成骨基因表达，从而进一步调节 PDLSCs 成骨分化［4，7，15，21］。

3.2 OSX是信号通路下游的重要成骨转录因子Osx是一种含有锌指基序结构的转录因子，属于Sp(special protein)家族，对细胞成骨分化和骨形成过程起关键作用。Osx的 C末端存在3个连续的Cys2-His2锌指基序结构，该结构可与真核细胞双链DNA的 G/C丰富区特异性结合，调控基因的转录［34］。目前研究证实Osx只在骨组织细胞中表达，在干细胞向成骨细胞分化过程中起决定性作用，没有Osx就没有骨形成和骨再生［35］。作为成骨途径下游的转录因子，Liu等［8］研究证实BMP9诱导干细胞成骨分化过程中会产生Osx，Mandal等［36］研究证实BMP家族成员可以通过Smads信号通路对Osx进行调控，赵艳红等［37］研究表明BMP家族成员诱导牙周膜细胞成骨分化过程中通过p38信号通路可激活调控 Osx，Choi等［38］则证实 ERK1/2信号通路参与对Osx的调控。目前暂无具体研究证明BMP9诱导PDLSCs成骨分化信号通路的下游产生Osx，但早前的研究证实Osx作为Runx2的下游因子，接受Runx2的调控激活，结合Ye等［4］的研究结论(BMP9诱导PDLSCs成骨分化并在信号通路下游产生Runx2)可推理:BMP9诱导PDLSCs成骨分化信号通路的下游产生Runx2和Osx。Osx的表达也可以加强Runx2的活性，两者协同转录产生 OCN、OPN、BSP等成骨标志物并在骨成熟过程中发挥重要作用［39］。

4 结 语

在牙周组织工程中，PDLSCs因具有显著增强牙周组织的形成和修复的能力，被认为是牙周组织工程最佳种子细胞。BMP9作为BMPs家族最强诱导细胞成骨分化的生长因子，通过与PDLSCs相互作用并诱导其成骨分化，可在牙周组织修复领域发挥重要作用并具有良好的临床应用前景。本文分析了BMP9诱导细胞成骨分化的2条重要途径——BMPSmads信号通路和BMP-MAPK信号通路，但是其他信号通路的作用以及各信号通路之间的联系仍然不甚明了，有待更进一步的研究证明。此外，相对于临床上已经应用的BMP2和BMP7，BMP9的临床安全性有待更深一步研究。

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