血浆DNA定量检测在慢性白血病患者疗效评估中的临床应用

张红梅，蒋 叶，李大千，夏文颖，陈 丹，荆俊鹏，王 悦，杨大恒，徐 建，潘世扬

0 引 言

循环DNA主要存在于人血浆和血清等体液中，大量研究表明，血浆DNA水平与肿瘤负荷相关，与肿瘤的诊断、治疗疗效、病程监测及预后密切相关［1-6］，但在血液系统肿瘤中的研究报道相对较少。慢性白血病是一组异质性造血系统肿瘤，慢性白血病细胞具有一定的分化成熟能力，多为较成熟的幼稚细胞和成熟细胞，其病情发展慢，自然病程可为数年，其中常见的是慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)和毛细胞白血病(hairy cell leukemia，HCL)。目前慢性白血病的诊断、疗效判断及病程监测在临床上多依赖骨髓组织细胞学检查。有研究报道，白血病患者外周血中循环DNA的异常增高早于骨髓检查，认为血浆循环DNA可代替骨髓细胞用于白血病的辅助诊断［7］。因此，本研究以慢性白血病患者为研究对象，初步探讨探讨血浆循环DNA定量检测在慢性白血病疗效评估中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2008年5月至2014年8月南京医科大学第一附属医院和南京市江宁医院血液科住院患者CML52例、CLL85例和HCL患者4例。男性99例，女性42例。CML患者中位年龄48岁，其中慢性期33例、急变期12例、加速期7例，经酪氨酸酶抑制剂TKI联合化疗后部分患者达完全血液学缓解或细胞遗传学缓解;CLL患者中位年龄61岁，在FC方案或FCR等方案化疗后，经CLL疗效标准判断［8］，28例患者达到完全缓解(complete remission，CR)，27例部分缓解(partial remission，PR)，30例未缓解(non-remission，NR)，分别为 CR组、PR组、NR组;HCL中位年龄62岁。选择南京市江宁医院80例体检健康者作为对照组，男性43例，女性37例，中位年龄45岁。

1.2 试剂与仪器 磁珠法提取DNA试剂盒(上海浩源公司)，PCR扩增试剂(TaKaRa公司)。目的基因βactin和标准内参照物重组质粒DNA的引物及TaqMan探针由Invitrogen公司合成，序列参见文献［9］。7500型荧光定量基因扩增仪(Applied Biosystems公司)。

1.3 标本处理 采集静脉血2 mL，EDTA-K2抗凝，于室温1 600×g离心10min，小心转移上层血浆，再于4℃、16 000×g离心10 min，上层无细胞血浆每管200 μL分装于加入人工重组质粒样品保存管中，涡旋混匀后置-70℃待测。

1.4 血浆DNA定量检测 用磁珠法对血浆DNA和重组质粒DNA同步提取，再对人β-actin基因和内参照质粒DNA进行双重荧光定量PCR，具体操作及计算参照文献［9-10］。

1.5 统计学分析 采用Stata/SE 9.2统计软件进行数据分析。血浆DNA定量结果资料呈非正态分布，以中位数［M(P25，P75)］表示，成组设计组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验，两两比较采用Whitney秩和检验;化疗前后比较采用Wilcoxon配对秩和检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 慢性白血病患者诊断时血浆DNA含量的测定诊断时，CML和CLL患者血浆DNA含量均显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)。而HCL患者血浆DNA含量与对照组比较差异无统计学意义(P=0.200)，CML、CLL 和 HCL 患者之间血浆 DNA含量差异亦无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.2 CML患者不同阶段血浆DNA含量测定 CML慢性期患者血浆DNA含量显著高于急变期患者和加速期患者，差异有统计学意义(P＜0.05)。但加速期患者和急变期患者血浆DNA含量差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表1。

2.3 CML患者在化疗前后DNA含量测定 CML患者化疗后血浆DNA含量显著低于化疗前血浆DNA含量，且显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.001)。见表1。

2.4 CLL患者不同化疗疗效组血浆DNA含量测定CLL患者CR组血浆DNA含量显著低于PR组和NR组，差异有统计学意义(P均＜0.001);与对照组血浆DNA含量比较，差异无统计学意义 (P=0.125)。PR组、NR组血浆DNA含量显著高于对照组 (P＜0.001)。见表1。

表1 慢性白血病患者不同时期血浆DNA含量的结果［M(p25，p75)，ng/mL)］Table 1 The level of plasma DNA in patients with chronic leukemia ［(M(p25，p75)，ng/mL］

3 讨 论

慢性白血病起病缓慢，病程长，早期多无明显症状，患者多在体格检查或其他疾病就诊时发现。95%的慢性白血病为CML，CML以慢性期起病，发病年龄在20～60岁，临床病程可分为慢性期、加速期及急变期。CLL主要见于老年人，病程进展缓慢，中位生存期＞10年。HCL较为少见，白血病细胞胞质形成细长的突起，形似绒毛，平均发病年龄50岁，预后多不良。目前，临床使用的最直接的判断慢性白血病化疗疗效的检测手段为骨髓穿刺和活检，但骨髓穿刺为有创检测。相关文献表明，循环血浆DNA可以作为早期监测肿瘤的分子生物标记［11-13］，并且可以评判肿瘤化疗疗效［14］。

循环DNA为主要存在于血液、滑膜液、脑脊液等体液中的细胞外DNA。Leon等［15］首先发现肿瘤患者血浆DNA水平明显增高，且与患者的预后及疗效有关;Stroun等［16］首先对肿瘤患者体内的游离循环DNA的序列进行了检测，在肿瘤患者体内的游离循环 DNA 上相继检测到了 K-ras、N-ras、P53、APC等基因的突变［2，4，17-19］。同时发现癌症患者在接受化疗后，其体内游离循环 DNA的浓度会降低到90%［20］，而正常人体内的游离循环DNA的水平就相对稳定。随后在肺癌、乳腺癌、消化道肿瘤等多种实体肿瘤中发现血浆DNA具有肿瘤相关的特征性改变［21-23］，提示循环DNA有望成为新的肿瘤分子标志物。

本研究结果显示，诊断时由于大量白血病细胞的存在，CML和CLL患者血浆DNA含量均明显高于对照组;HCL患者血浆DNA含量亦高于对照组但无差异，这可能是样本数偏少所致。由此推断慢性白血病患者体内大量肿瘤细胞释放DNA导致血浆DNA水平升高，Stroun等［23］证实游离循环DNA先是在细胞内复制合成，然后释放出细胞，新合成的DNA被优先释放。在CML患者中，慢性期患者血浆DNA含量明显高于急变期和加速期患者。原因是CML慢性期白细胞计数显著增高，释放大量DNA，而进入加速期和急变期后，由于降白细胞治疗，白细胞数量相比慢性期显著降低;其血浆DNA水平亦相应降低。

本研究前期已证实，血浆DNA定量检测在AML和ALL的的化疗疗效评估中均具有重要意义［24-25］。本研究对 CML患者进行化疗后血浆DNA的定量检测，其血浆DNA水平显著低于化疗前但显著高于对照组，结果表明CML患者在接受化疗后病情得到有效控制，但因为疾病进展缓慢，故而病情恢复亦缓慢。对CLL患者化疗后不同疗效组血浆DNA水平研究结果显示，CR组与对照组之间无差异，提示患者化疗效果良好，病情得到有效控制。PR组血浆DNA水平显著高于对照组及CR组，但显著低于NR组，结果提示患者化疗后病情有所控制，但治疗效果并不理想;或者患者化疗前病情严重于CR组患者;抑或患者因个体差异导致治疗效果差异。NR组患者化疗后血浆DNA水平显著高于对照组、CR组及PR组，结果提示该组患者化疗效果无效或者治疗效果不好，需要进一步化疗或者更改化疗方案。

本研究结果表明，血浆DNA的定量检测在慢性白血病的化疗疗效评价中具有重要的临床意义。尽管CML已经有非常好的分子生物学疗效评估指标BCR/ABL，但是BCR/ABL检测需要通过骨髓穿刺获得患者的骨髓标本，此项检测为有创检测。血浆循环DNA检测仅需要患者血液，为无创检测。血浆DNA定量检测具有取样方便、无创、敏感性高、重复性好等优势，可减少患者反复骨髓穿刺的创伤，方便临床医师对随访患者的病情进展及疗效进行监测［26］。

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