野生桦褐孔菌的鉴定及ITS序列系统发育分析1)

侯橙 宋福强 刘雪峰 董爱荣

(东北林业大学，哈尔滨，150040) (黑龙江大学) (东北林业大学)

野生桦褐孔菌的鉴定及ITS序列系统发育分析1)

侯橙 宋福强 刘雪峰 董爱荣

(东北林业大学，哈尔滨，150040) (黑龙江大学) (东北林业大学)

依据子实体的形态特征、培养特性，对采自黑龙江省大兴安岭呼中国家级自然保护区的野生药用真菌进行了鉴定。结果表明：该菌PCR扩增产物长761 bp。ITS序列聚类结果表明，该菌种与Inonotusobliquusisolate FS656163以及Inonotusobliquusstrain MDJCBS88同源性最近，为桦褐孔菌的不同菌株，而与Inonotuslinteusstrain PL08121和Inonotusrickiiisolate PF241亲缘性最远，都属于纤孔菌属。结合分子生物学与形态学鉴定，一致确定其为桦褐孔菌(Inonotusobliquus)。

桦褐孔菌；形态学；ITS

桦褐孔菌(Inonotusobliquus)属真菌门(Eumycota)担子菌亚门(Basidiomycotina)层菌纲(Hymenomycetes)非褶菌目(Aphyllophorales)多孔菌科(Polyporaceae)纤孔菌属[1]，俗称桦癌褐孔菌、白桦茸、斜管纤孔菌，欧洲人称之为chaga[2]，是一种具有很高药用价值、应用前景广泛的真菌，可用于治疗各种消化道癌症、降血糖、防治艾滋病、抗衰老、降血脂、降血压，还能够改善过敏体质，增强免疫力[3]。桦褐孔菌主要寄生于白桦(Betulaplatyphylla)、银桦(Grebillearobusta)、榆(Ulmuspumila)、赤杨(Alnusjaponica)等落叶树活立木的树皮下或倒木枯干上，形成不育的木腐菌，其菌核可以在砍伐后的枯干上生存6年之久，菌丝体耐受低温能力极强。该菌主要分布于北纬45°～50°地区的苦寒地带，如俄罗斯、中国黑龙江大小兴安岭、吉林省长白山、北美北部及日本北海道[4-5]。

传统的真菌分类鉴定主要是依据子实体的形态特征，其优点是鉴定方法简单，鉴定结果直观，缺点是无法对只有菌丝体的菌种材料进行直接的鉴定，而分子鉴定方法可以对菌丝体材料进行直接的鉴定。此研究基于前人对该属真菌部分种类ITS序列的测序结果，对桦褐孔菌进行了形态学鉴定和ITS序列PCR扩增，并构建了纤孔菌属真菌的ITS序列系统发育聚类树。

1 材料与方法

1.1 标本采集

2011年5月份，在大兴安岭呼中国家级自然保护区原始白桦林内，以散点法寻找无病虫害、生长年数超过5 a的子实体，利用镰刀、斧子等工具在树木表面采集，采集深度为树木表层1～3 cm，并对子实体拍照、编号，记录子实体形态特征。将子实体保持完整装入标本盒中，采回后立即用PDA平板分离纯化培养。

1.2 菌种分离与纯化

采用伞菌分离法，首先用无菌棉球沾无菌水擦掉子实体表面的木屑，75%的酒精对子实体表面消毒，然后在超净台中徒手掰开子实体，用消毒的解剖刀在深部生长部位割取组织，迅速放入灭菌的虎红固体培养基，封口后置于恒温培养箱内培养，3日后将纯菌转入PDA固体培养基培养，每日观察菌落生长状况记录拍照。同时转接到试管斜面上，置于恒温培养箱中25 ℃培养，长满后置冰箱中4 ℃保存备用。

1.3 形态学鉴定

根据子实体、菌丝体生长特征，参照戴玉成的《中国东北野生食药用真菌图志》、卯晓岚的《中国大型真菌》对其进行观察对照。徒手切片后，显微镜下观察真菌菌丝体及菌落形态、大小、色泽等特征[6-7]。

1.4 ITS序列系统发育分析

菌丝体总DNA提取：菌种用打孔器转接至PDA液体培养基里28 ℃、120 r·min-1摇床培养7 d，摇培结束后将培养液离心，取菌丝体，菌丝体经去离子水水洗，再离心，这样重复操作几次，收集菌丝体。采用改良的CTAB法提取桦褐孔菌基因组总DNA，0.7%琼脂糖凝胶电泳检测其质量[8]。

PCR扩增：采用ITS-rDNA通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，以所提取菌种的DNA为模板，按照表1反应体系冰上操作扩增ITS区。

表1 25 μL ITS-rDNA扩增反应体系

PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，35个循环反应；循环后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR产物纯化、克隆及测序：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检验后采用TaKaRa Fragment Purification Kit(TaKaRa，Cat. No. DV807A)纯化，过程按操作手册进行。分光光度计检测纯化产物浓度，按目标片段与载体pGEM-T Easy Vector(promega，Prod.No.A1360)的质量比为1∶3的比例建立连接体系，4 ℃过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布于X-gal/IPTG LB平板上过夜。挑取白色菌落，PCR扩增法初步筛选阳性克隆后送上海生物工程有限公司测序。

数据分析：将测定的ITS-rDNA序列用软件DNA-MAN进行序列拼接，登录http//:www.ncbi.nlm.nih.-gov，用BLAST程序与GenBank中的ITS序列进行同源性比较，并把相关的序列下载，将测得的序列和下载的序列进行完全对比，将获得的ITS-rDNA序列提交到GenBank数据库并获得登录号，选择同源性较近的序列构建系统发育树，结合文献报道，通过ITS序列比对，序列相似性大于或等于99%时，判断为同种；序列相似性介于95%至99%之间，判断为相同属；序列相似性小于或等于95%，判断为相同科[9]。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定结果

从大兴安岭呼中国家级自然保护区采集回来的野生桦褐孔菌子实体呈黑褐色不规则瘤状，表面坚硬，质地硬脆，子实体外部较干，用斧子砍开切面处手感湿润。菌肉木栓质，有模糊不清的环纹，淡黄褐色(图1)。

图1 桦褐孔菌子实体

PDA固体平板中培养7 d的菌落上的菌丝浓厚、整齐，从中心向四周生长；菌落中心颜色呈黄褐色，从中心至边缘黄色逐渐变淡，外围纯白色；平板背面菌落有明显的浅褐色环纹(图2)。菌种接到PDA液体培养基，在柜式恒温摇床中120 r·min-1，28 ℃下培养7 d，菌球边缘呈尖刺状；摇瓶壁上的菌丝带变粗，部分被摇落到液体中；摇瓶中液体颜色由淡黄色逐渐变为深褐色，脱落的菌丝结合为圆形或卵形菌丝球(图3)。挑取平板的营养菌丝体压片后在光学显微镜下观察，菌丝呈半弧形，透明，丝状。营养菌丝多分枝，可见菌丝横隔，无锁状联合。

图2 桦褐孔菌平板分离

图3 桦褐孔菌菌球

2.2 ITS序列系统发育

应用改良的CTAB法提取到桦褐孔菌的基因组DNA片段，经电泳检测，凝胶成像系统照相，得到基因组DNA电泳图谱，在15 000 bp附近出现基因组条带(图4)。用通用引物ITSI和ITS4对桦褐孔菌基因ITS-rDNA片段进行PCR扩增，经电泳检测，扩增后产生单一清晰的条带，可供进一步的纯化与克隆。4个桦褐孔菌菌株的PCR扩增产物平行样扩增后的片段长度都在750 bp左右(图5)。

图4 桦褐孔菌的基因组DNA

本研究采集的野生菌株的ITS-rDNA经测序获得的目的片段长度为761 bp，包含18S rDNA部分序列，306 bp ITS1序列全长，160 bp 5.8S rDNA全长，243 bp ITS2全长，以及部分28S rDNA序列。在GeneBank上经BLAST比对，与Inonotusobliquus的ITS-rDNA序列有99%的相似性，结合形态观察，确定所采的野生菌种为桦褐孔菌。序列已提交NCBI上的EST库，其在GenBank上的登陆号为：KC312697(GI:461725870)，核苷酸序列(5′→3′)如下：

GACTCCTGATTTGAGGTcAaAGGTGTCAAGAAG

GCCCAACGAAGGGATCCTTGTCCAACTTAAGGACT

ATTAGAAGCAGACTTGTTAGGCAAGCGTCTTAGTG

AACATTACATTATTACACCGTAAACGCGAACCAAA

GTCCAGCTAATGTATTTGAGAGGAGCCGACAAACC

AAGGGCAACCAAAGTCGCCCGGGCCAGCAAAACC

TCCAAGTCCAAATCGAAAGCCACTTCAATTAAGAA

TAGACGAGCGATTTGAGATTAACATGACACTCAAA

CAGGCATGCCCCTCGGAATACCAAGGGGCGCAAGG

TGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCA

ATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCAT

CGATGCGAGAGCCTAGAGATCCGTTGTTGAAAGTT

GTATTTATTATCGCCCACAAGGAGCATTTCATTCAC

ATAACAATTATATTGGTGTTTGTAATGAAGCCAAAA

GCTTTTCGTCTCCTTGTCTCTGAAGCTTGCCTTTCCA

TCTTTCACACTTTCCAAGGGCCGAAACCCTCGTACT

TGATTACTCGACGTACTTGACTTGCCGTTCGATTAC

AGAAACTACTAAGACCTTCAACTTGTATAGGTGCAC

AGGGGTTTGAGAGTTGGATTTGAGCACGAAAGGCC

GTGCACATGCAAACGTTTCCGTGCCAGCACAGGCC

CCTCGATTTCAAAATAAACTCGATAATGATCCTTCC

GCAGGTTCACCTACGGAA

图5 桦褐孔菌ITS-rDNA PCR扩增结果

通过BLAST软件的分析，对桦褐孔菌菌株测得的序列和GenBank中下载的ITS-rDNA序列进行聚类分析，应用MEGA5.03软件建立基于ITS序列的系统发育树(图6)。从图6可以看出，采集的菌种目标序列与InonotusobliquusisolateFS656163以及InonotusobliquusstrainMDJCBS88同源性最近，这2个为桦褐孔菌不同菌株，而与InonotuslinteusstrainPL08121和InonotusrickiiisolatePF241亲缘性最远，二者都属于纤孔菌属。

图6 基于ITS-rDNA的桦褐孔菌系统发育进化树

3 结束语

本研究应用可靠便捷的ITS-rDNA序列分析方法对1株野生桦褐孔菌菌株进行分类鉴定。在鉴定过程中发现，同一科下不同属的近缘菌株序列都具有较高的同源性，来自不同地区的菌株在ITS区具有很高的相似性，需要结合其他的分析方法如形态特征来进行综合评价。本研究以ITS-rDNA为遗传标记，系统发育比对结果显示此野生菌株与桦褐孔菌(Inonotusobliquus)有99.0%的相似度。应用PCR等传统分子生物学方法，结合该菌株子实体形态特征、菌丝生长情况和显微镜检等形态学观察，参照《中国东北野生食药用真菌图志》、《中国大型真菌》的相关描述，最终确定此野生菌株为桦褐孔菌(Inonotusobliquus)。ITS-rDNA测序结果为761 bp，已经提交至NCBI上的EST库，其在GenBank上的序列号为：KC312697(GI:461725870)。

[1] 林碧贤,李晔,毛景华,等.药用真菌白桦茸：桦褐孔菌[J].海峡药学,2004,16(6):74-76.

[2] 卯晓岚.中国大型真菌资源及其评价[J].西北植物学报,1989,9(1):52-61,68.

[3] 黄年来.俄罗斯神秘的民间药用真菌：桦褐孔菌[J].中国食用菌,2002,21(4):7-8.

[4] 梁清乐,王秋颖,樊锦燕,等.桦褐孔菌的研究概况[J].中草药,2005,36(4):623-625.

[5] 陈体强,吴锦忠.珍稀药用菌：桦褐孔菌的研究进展[J].海峡药学,2005,17(2):1-3.

[6] 戴玉成,图力古尔.中国东北野生食药用真菌图志[M].北京:科学出版社,2007:95.

[7] 卯晓岚.中国大型真菌[M].郑州:河南科学技术出版社,2000:465.

[8] 陈艳秋.桦褐孔菌菌株遗传多样性及人工培养条件优化模式研究[D].长春:吉林农业大学,2007.

[9] Landeweert R, Leeflang P, Kuyper T W, et al. Molecular identification of ectomycorrhizal mycelium in soil horizons[J]. Applied and Environmental Microbiology,2003,69(1):327-333.

Diagnosis and ITS Phylogenetic Analysis ofInonotusobliquus//

Hou Cheng

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P.R. China); Song Fuqiang(Heilongjiang University); Liu Xuefeng, Dong Airong(Northeast Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University，2015,43(9)：128-130,133.

On the basis of the fruiting body morphology and its cultural characteristics, we identified the wild medicinal fungi collected from Daxing’an Mountains Huzhong National Nature Reserve of Heilongjiang Province. The length of the PCR product was 761 bp. We took the phylogenetic analysis of the ITS region forInonotus. The phenogram inferred from the alignment showed thatI.obliquuswas evolutionarily closely related to isolate FS656163 and strain MDJCBS88, and evolutionarily the furthest related toI.linteusstrain PL08121 andI.rickiiisolate PF241. By the molecular and morphological identification, we identified the species asI.obliquus

Aphelenchoidesbesseyi; Morphology; ITS

1)国家林业局公益性项目(201004079)。

侯橙，女，1992年5月生，东北林业大学林学院，硕士研究生。E-mail：624477196@qq.com。

董爱荣，东北林业大学林学院，副教授。E-mail：darlmy@tom.com。

2015年3月25日。

S718.81

责任编辑：程 红。