多肽修饰载紫杉醇PLGA微球的制备技术＊

袁晓燕 刘为青 董坚 高嫦娥 刘冬 袁明龙

（1.昆明医科大学第三附属医院·云南省肿瘤医院，云南 昆明6 500118；2.昆明医科大学第一附属医院生物治疗中心，云南 昆明 650032；3.云南民族大学 化学与生物技术实验室，云南 昆明 650500）

紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是从红豆杉属植物中分离出来的一种四环二萜类化合物，为一类抗微管活性药物，对许多恶性肿瘤细胞显示了强大的杀伤性，它能与细胞微管蛋白结合，促进微管聚合及排列异常，扰乱细胞分裂过程中微管的动态平衡，从而杀死细胞［1，2］。目前，紫杉醇多用于卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、大肠癌、头颈部癌等的临床治疗。疗效优于临床早期使用的蒽环类药物，但水溶性差、治疗剂量安全范围窄而限制了其的临床应用。市售的紫杉醇注射剂采用聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor，EL）／无水乙醇（50∶50，V／V）配制，其中聚氧乙烯蓖麻油会引起严重的过敏反应及高血压［3－5］。

国际癌症研究机构（IARC）报道每年有超过1000万癌症新发病例，全世界每年约600 万患者死于癌症，化疗期间产生耐药性是肿瘤患者复发、转移，甚至死亡的关键［6，7］。微球为新 型载药体 系，可携带DNA、多肽、药物等进入细胞，靶向性载药微球能特异性的作用于肿瘤细胞，减少传统化疗药物的毒副作用，增加药物对耐药性肿瘤的疗效，且能为病人提供个体化的治疗［6－9］。乳酸－羟基乙酸共聚物（PLGA）为一种高分子材料，具有生物相容性好、可降解缓释控释等优势，已被美国FDA 批准用于临床［10，11］。为了克服传统化疗药物的不良反应，降低紫杉醇的毒副作用及提高治疗靶向性，本研究经过不断探索成功制备了经三阴性乳腺癌特异性转导多肽PI修饰的载紫杉醇PLGA 微球［12－14］，微球载药技术与靶向生物分子的成功联合为以后靶向载药体系的构建提供了新途径。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 高速分散匀质机（T18，IKA，Germany）；恒速电动搅拌器（JJ－1B，澳华仪器有限 公司，江苏常州）；台式高速离心机（TGL20M，凯达实验仪器有限公司，江苏盐城）；高效真空冷冻干燥机（LMC－2，Chirist Germany）；高效液相色谱仪（Agilent Technologies 1200series，USA）；C18色谱柱（5um，250mm×4.6mm，WATERS）扫描电子显微镜（HITACHI，S－3000，Japan）；激光粒度分析仪（Winner 2000，济南微纳颗粒仪器股份有限公司）；倒置荧光显微镜（OLYMPUS，DP73，Japan）。

1.1.2 试剂 紫杉醇（Paclitaxel，云南汉德生物技术有限公司，纯度＞99.3%）；乳酸－羟基乙酸共聚物（PLGA，LA／GA＝50∶50，相对分子量为14970，云南民族大学化学与生物技术实验室）；聚乙烯醇（PVA，成都市科龙化工试剂厂）；乙腈（色谱级，MREDA 科技有限公司）；MICRO PES 聚醚砜滤膜（0.22μm，MEMBRANA 公司，德国）；1－乙基－3－（3－二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC.HCL，adamas－beta瑞士）；N－羟基琥珀酰亚胺（NHS，adamas－beta瑞士）；2－（N－吗啡啉）乙磺酸（MES，adamas－beta瑞士）；三阴性乳腺癌特异性转导多肽（FITC－PI）；其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 载紫杉醇的PLGA 微球（PTX／PLGA 微球）的制备 精密称取20mg的紫杉醇、0.8g的PLGA 于试管中，加入5ml的二氯甲烷溶解，用高速分散匀质机分散2min（30000r／min）得到有机相。而后在高速分散机的搅拌下将有机相缓慢注入1%的聚乙烯醇水相中，分散5min（30000r／min）后获得o／w 状态的乳液，整个过程需在冰浴条件下进行。将得到的乳液缓慢加入到远大于其体积的5%的异丙醇溶液中，用恒速搅拌机搅拌5h，以使二氯甲烷充分挥发。最后将得到的微球混悬液高速离心10min（12000r／min），收集沉积下来的微球用超纯水洗涤3 遍以除去未包载的药物及乳化剂，在真空冷冻干燥条件下过夜，得到白色冻干粉。

1.2.2 FITC－PI修饰的载紫杉醇PLGA 微球（PIPTX／PLGA 微球）的制备 精密称取0.2g的PTX／PLGA－NPs于10ml的MES缓冲液（pH＝5.6）中，超声下分散，加入含0.7M NHS和0.1M EDC 的MES缓冲液1ml反应1h，以使PLGA 微球上的羧基充分活化。收集活化后的微球，用MES 缓冲液（pH ＝5.6）洗涤3遍以去除未反应的NHS和EDC，接着加入5ml的PBS缓冲液（pH＝7.2）形成微球悬液，将荧光标记的PI多肽（FITC－PI）加入悬浮液中，于磁力搅拌器上低温避光搅拌过夜，使PTX／PLGA 微球的活化羧基与PI 多肽的氨基脱水偶联得到PI－PTX／PLGA微球，真空干燥后避光低温保存。

1.2.3 扫描电子显微镜观察微球形态 取少量微球冻干粉末于样品台上，用洗耳球吹散开，喷金，放于扫描电镜下观察。分别观察PLGA 空白微球、PTX／PLGA 微球、PI－PTX／PLGA 微球在扫描电镜下的形态。

1.2.4 微球粒径测定 将微球加入超纯水中，以搅拌和超声使样品在介质中充分分散，采用光散射原理测量微球水力学直径。

1.2.5 包封率和载药量的测定 采用高效液相色谱法（HPLC）测定。色谱条件：流动相为乙腈－水（50∶50）；流速为1.0ml／min；柱温为30℃；检测波长为227nm；进样量为20μl。

紫杉醇原药标准曲线测定：精密称取紫杉醇原药25mg于250ml的量瓶中，加入流动相溶解，并定容至刻度线，得到浓度为0.1mg／ml的紫杉醇储备液。分别取适量储备液于25ml的量瓶中，以流动相稀释至刻度 线，得到终浓 度分别为1.0、2.0、5.0、20.0、50.0μg／ml的紫杉醇标准液。以峰面积（Y）为纵坐标，标准液浓度（X）为横坐标得标准曲线。

微球中所含紫杉醇量的测定：称取微球（PTX／PLGA 微 球、PI－PTX／PLGA 微 球）20mg 于25ml的量瓶中，用如上方法配制样品液，测得样品液中所含紫杉醇的峰面积，带入标准曲线方程得到紫杉醇浓度，反复测量取平均值。以下列方程式求得载药量和包封率：

1.2.6 荧光显微镜观察PI与载药微球的偶联 取少量PI－PTX／PLGA 微球于试管中，加入超纯水，以超声充分分散，将悬液滴于载玻片上置于荧光显微镜下观察，以蓝光激发PI所带荧光染料。

2 结果

2.1 微球形貌和粒径分析：本研究采用乳化－溶剂挥发法成功制备了PLGA 微球。扫描电镜观察到微球表面光滑、完整，未见明显空隙，分散良好（图1）。与空白PLGA 微球相比PTX／PLGA 微球 及PI－PTX／PLGA 微球粒径略有增大，可能与包载了药物或与多肽连接有关，这与激光粒度仪分析的结果一致。由图1（C）可见以化学的方式将多肽的氨基与PTX／PLGA－NPs上的羧基相连，并未破坏微球的结构和增加微球之间的粘连。

图1 扫描电镜微球形貌所见Figure 1 Microsphere by scanning electron microscope

2.2 FITC－PI修饰微球后的荧光显像 PI与PTX／PLGA 微球经过EDC和NHS化学连接后，经荧光显微镜检测（图2）显示荧光信号分布在微球表面，覆盖率高，对照组微球未见荧光信号。

图2 荧光显微镜检测FITC－PI在PTX／PLGA微球表面的分布（×200）Figure 2 Distribution of FITC－PI on PTX／PLGA microspheres（×200）

2.3 微球载药量和包封率的测定 高效液相色谱法（HPLC）测得标准品峰面积，以此绘图得标准曲线方程式：Y＝33.783X＋2.7178（R2＝1），表明紫杉醇在1.0μg／ml～50.0μg／ml浓度范围内线性关系良好。

HPLC法测定两种载药微球样品液中所含紫杉醇峰面积，记录色谱图（图3）。并以相同的色谱条件对空白NPs和PI－FITC进行检测。结果示：紫杉醇的峰保留时间出现在10min附近，PTX／PLGA 微球及PI－PTX／PLGA 微球样品液在此段时间也有出峰，而空白PLGA 微球和FITC－PI在227nm 处相同色谱条件下并无吸收峰，因此不会干扰药物含量测定，由此表明微球成功包载了紫杉醇。PTX／PLGA 微球的载药量和包封率分别为2.8%和91%，而PI－PTX／PLGA 微球的载药量和包封率略有降低为2.5%和84%，多是由于PTX／PLGA－NPs重悬于水溶液与多肽结合的过程中PTX／PLGA－NPs表面的紫杉醇丢失所致。

图3 HPLC 色谱图Figure 3 HPLC chromatogram

3 讨论

2006年欧洲科学与技术机构（ESTO）的调查显示全球有超过150个国家正在研究载药微球，约有24种已用于临床［15］。近几年来，纳米材料的研究和应用发展迅速，其具备了其他材料所没有的独特作用：纳米材料制备的微球可依据疾病需求选择大小；纳米粒可通过细胞内吞作用携带药物进入细胞，减少了耐药细胞对药物的外排；纳米粒表面能与蛋白等物质结合，靶向性的作用于病变组织［16，17］。现代分子生物学的发展已经证实了肿瘤的发生、侵袭和转移与肿瘤细胞基因组上的突变和异常表达相关［18，19］，基因组学和蛋白组学的发展使得肿瘤细胞表面特异性靶点被识别［20］，肿瘤靶点相关性的载药微球受到医学界广泛关注，靶向性的载药微球能提高靶细胞的药物摄取率使药物更大程度的聚集在病变组织、改善疾病疗效、降低药物毒副反应［15，17，21－23］。

乳酸－羟基乙酸共聚物（PLGA）是一种成熟的可生物降解的高分子聚合物，在体内分解为乳酸和乙醇酸单体，并通过三羧酸循环代谢。PLGA 塑形性好，能包载不同类型的药物，减少药物在体内运输过程中的降解，具有缓释、控释、表面易修饰作用［24，25］。溶剂挥发法为制备PLGA 微球常用方法，紫杉醇为疏水性药物，能很好的溶于有机溶剂，采用O／W 状态的乳化－溶剂挥发法制备载紫杉醇的PLGA 微球时能获得很高的包封率［26］。

实验采用的高分子材料PLGA 含有大量羧基，在EDC／NHS交联体系中充分活化后，能与多肽携带的氨基通过脱水缩合形成酰胺键（R－CO－NH－R）。本研究通过扫描电镜、激光粒度仪、高效液相色谱法及荧光显微成像证实化学连接方法并没有破坏PLGA 微球的结构，此法获得的微球于超纯水中分散性好，无明显粘连和聚集，经多肽修饰后的载药微球仍保持着较高包封率。多肽修饰的微球白色冻干粉在超纯水中分散后置于荧光显微镜下观察可见微球表面布满绿色荧光，而对照组并没有荧光信号，证明化学交联法能将多肽牢固的连于PLGA 微球上，稳定性好，易于储存。

4 结论

本实验成功构建了经多肽修饰的新型载紫杉醇PLGA 微球，该药有望降低市售紫杉醇剂型的不良反应，提高紫杉醇的临床疗效和靶向性。此方法的建立为其他靶向性生物分子（如：细胞转导域、单克隆抗体等）与载药微球的联合提供了新的途径。

【参看文献】

［1］Rowinsky EK，Donehower RC.PACLITAXEL（TAXOL）［J］.N ENGL J MED，1995，332（15）：1004－1014.

［2］Wertz IE，Kusam S，Lam C，et al.Sensitivity to antitubulin chemotherapeutics is regulated by MCL1and FBW7［J］.Nature，2011，471：110－114.

［3］Singla AK，Garg A，Aggarwal D.Paclitaxel and its formulations［J］.International Journal of Pharmaceutics，2002，235：179－192.

［4］Feng SS，Mu L，Win KY，et al.Nanoparticles of Biodegradable Polymers for Clinical Administration of Paclitaxel［J］.Current Medicinal Chemistry，2004，11（4），413－424.

［5］Liggins RT，Amours SD，Demetrick JS，et al.Paclitaxel loaded poly（L－lactic acid）microspheres for the prevention of intraperitoneal carcinomatosis after a surgical repair and tumor cell spill［J］.Biomaterials，2000，21：1959－1969.

［6］Iyer AK，Singh A，Ganta S，et al.Role of integrated cancer nanomedicine in overcoming drug resistance［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，2013，65：1784－1802.

［7］Swanton C，Marani M，Pardo O，et al.Regulators of Mitotic Arrest and Ceramide Metabolism Are Determinants of Sensitivity to Paclitaxel and Other Chemotherapeutic Drugs［J］.Cancer Cell，2007，11：498－512.

［8］Xu S，Olenyuk BZ，Okamoto CT，et al.Targeting receptor－mediated endocytotic pathways with nanoparticles：Rationale and advances［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，2013，65：121－138.

［9］Caldorera－Moore ME，Liechty WB，Peppas NA.Responsive Theranostic Systems：Integration of Diagnostic Imaging Agents and Responsive Controlled Release Drug Delivery Carriers［J］.Accounts of Chemical Research，2011，44（10）：1061－1070.

［10］Kou G，Gao J，Wang H，et al.Preparation and Characterization of Paclitaxel－loaded PLGA Nanoparticles Coated with Cationic SM5－1Single－chain Antibody［J］.Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2007，40（5）：731－739.

［11］Vasir JK，Labhasetwar V.Biodegradable Nanoparticles for Cytosolic Delivery of Therapeutics［J］.Adv Drug Deliv Rev，2007，59（8）：718－728.

［12］Dong J，Liu WQ，Jiang AM，et al.A novel peptide，selected from phage display library of random peptides，can efficiently target into humanbreast cancer cell［J］.Chinese Science Bulletin，2008，53（6）：860－867.

［13］刘为青，董坚，赵德萍，等.乳腺癌细胞高亲和融合多肽蛋白的表达以及靶向转运［J］.基础医学与临床，2009，29（3）：229－233.

［14］耿计伟，董坚，刘为青，等.乳腺癌特异性多肽介导的HSV－TK／GCV 系统的构建及其靶向杀伤效应［J］.Chin J Cancer Biother，2011，18（4）：383－388.

［15］Wang AZ，Gu F，Zhang LF，et al.Biofunctionalized targeted nanoparticles for therapeutic Applications［J］.Expert Opin Biol Ther，2008，8（8）：1063－1070.

［16］Patlak M.Nanotechnology Takes a New Look at Old Drugs［J］.NEWS，2010，102（23）：1753－1755.

［17］Farokhzad OC，Cheng JJ，Teply BA，et al.Targeted nanoparticleaptamer bioconjugates for cancer chemotherapy in vivo ［J］.PNAS，2006，103（16）：6315－6320.

［18］Riccio G，Avino CD，Raines RT，et al.A novel fully human antitumor ImmunoRNase resistant to the RNase inhibitor［J］.Protein Engineering Design ＆Selection，2013，26（3）：243－248.

［19］Shah SP，Roth A，Goya R，et al.The clonal and mutational evolution spectrum of primary triple－negative breast cancers［J］.Nature，2012，486：395－399.

［20］Acharya S，Sahoo SK.PLGA nanoparticles containing various anticancer agents and tumour delivery by EPR effect［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，2011，63：170－183.

［21］Levy－Nissenbaum E，Radovic－Moreno AF，Wang AZ，et al.Nanotechnology and aptamers：applications in drug delivery［J］.Trends in Biotechnology，2008，26（8）：442－449.

［22］Derycke ASL，Kamuhabwa A，Gijsens A，et al.Transferrin－Conjugated Liposome Targeting of Photosensitizer AlPcS4to Rat Bladder Carcinoma Cells［J］.Journal of the National CancerInstitute，2004，96（21）：1620－163.

［23］Changa J，Jallouli Y，Kroubia M，et al.Characterization of endocytosis of transferrin－coated PLGA nanoparticles by the bloodbrain barrier［J］.International Journal of Pharmaceutics，2009，379：285－292.

［24］Danhier F，Ansorena E，Silva JM，et al.PLGA－based nanoparticles：An overview of biomedical applications［J］.Journal of Controlled Release，2012，161：505－522.

［25］Enlow EM，Luft JC，Napier ME，et al.Potent Engineered PLGA Nanoparticles by Virtue of Exceptionally High Chemotherapeutic Loadings［J］.Nano Lett，2011，11：808－813.

［26］O'Donnell PB，McGinity JW.Preparation of microspheres by the solvent evaporation technique［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，1997，28：25－42.