醒脑丸对血管性痴呆大鼠脑组织谷氨酸及乳酸含量的影响

陈 杰,陶根鱼

(1. 陕西省中医医院，陕西 西安 710003；2. 陕西中医药大学，陕西 咸阳 712000)

醒脑丸对血管性痴呆大鼠脑组织谷氨酸及乳酸含量的影响

陈 杰1,陶根鱼2

(1. 陕西省中医医院，陕西 西安 710003；2. 陕西中医药大学，陕西 咸阳 712000)

目的研究醒脑丸对血管性痴呆(VD)大鼠脑组织中乳酸(LD)、谷氨酸(Glu)含量的影响。方法先将60只SD大鼠随机分为正常组8只和造模组52只，造模组采用结扎双侧颈总动脉(2-VO)法制作VD模型，然后将造模成功VD大鼠随机分为模型组、脑复康组、醒脑丸低剂量组、醒脑丸中剂量组、醒脑丸高剂量组。造模35d后，脑复康组开始给予脑复康84mg/kg灌胃，醒脑丸低、中、高剂量组分别给予醒脑丸水溶液0.21g/kg、0.42g/kg、0.84g/kg灌胃，正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃，均每天1次，持续14d；末次灌胃后当天进行大鼠行为实验，采用比色法测定大鼠脑组织中LD、Glu含量。结果模型组大鼠学习能力明显低于正常组(P<0.05)，各给药组大鼠的学习能力明显高于模型组(P均<0.05)。模型组大鼠脑组织中LD、Glu含量均明显高于正常组(P均<0.05)，各给药组大鼠脑组织中LD、Glu含量明显低于模型组(P均<0.05)。结论醒脑丸能够改善VD大鼠的学习记忆能力，其作用可能是通过降低脑组织中Glu及LD含量实现的。

血管性痴呆；大鼠；醒脑丸；谷氨酸；乳酸

血管性痴呆(Vascular Dementia，VD)是指一组由缺血性和/或出血性脑血管疾病引起的脑功能损害所致的痴呆，好发于老年人群，多见于中风之后。目前认为，脑创伤病理过程中存在大量的谷氨酸(Glutamate,Glu)释放，Glu是中枢神经系统中的兴奋性递质，参与感光信息处理、协调运动、认知活动等过程，在缺血情况下，其浓度急剧升高，引发钙超载、凋亡及氧自由基损伤等，使蛋白激酶、磷酸酶、钙蛋白酶等代谢紊乱，导致迟发性神经元坏死[1]。而细胞缺氧、缺血后能量消耗，ATP 的产生减少，无糖酵解增加，产生大量的乳酸(LD)，组织乳酸酸中毒可导致不可逆性神经损伤[2]。醒脑丸由黄芪、当归、水蛭、三七、菖蒲、何首乌等十余种药材精制而成，具有益气活血、醒脑开窍的作用，临床用于治疗VD取得了较好效果。为探讨该药治疗VD的作用机制，笔者观察了醒脑丸对VD大鼠学习记忆能力及脑组织中LD、Glu含量的影响，现将结果报道如下。

1 实验资料

1.1实验动物 一级SD大鼠60只，雌雄各半，体质量150～160 g，医动字第08-005号，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

1.2主要药品与试剂 醒脑丸，由陕西中医学院制药厂制备；吡拉西坦片(脑复康片)，济南利民制药有限责任公司，批号：060203； 注射用青霉素钠，哈药集团制药总厂，批号：A05108108；红霉素软膏，芜湖三益制药有限公司，批号：060201；生理盐水，西安京西双鹤药业有限公司，批号：051005122；10%水合氯醛，陕西中医学院附属医院制剂中心；Glu试剂盒，南京建成生物工程研究所生产；LD试剂盒，南京建成生物工程研究所生产；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所生产。

1.3模型的建立及分组给药 SD大鼠正常适应性饲养3 d后随机分为正常组8只与造模组52只。第4天开始让大鼠进行游泳，以熟悉水迷宫环境，连续3 d。第7天采用结扎双侧颈总动脉(2-VO)法[3]建立慢性脑灌注不足VD动物模型：手术前12 h禁食，术前4 h禁水。采用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉，确保大鼠能够自主呼吸。待大鼠翻正反射消失后，将其仰卧固定于手术台上，颈前部去毛，从腹侧颈正中划开，钝性分离大鼠的皮下脂肪、胸锁乳头肌及胸骨舌骨肌等，显露大鼠的颈动脉，以“0”号丝线双重结扎，随后缝合肌肉、皮肤。手术结束后将大鼠放置于通风良好的动物房进行饲养，伤口涂抹红霉素与青霉素预防感染。造模完成的第31天，让存活大鼠持续游泳5 d，进行水迷宫试验，以正常组大鼠隐匿平台逃避潜伏期(EL)的平均值作为参考值，计算结扎大鼠EL平均值与参考值之差占该鼠EL的比值，比值>20%判断为痴呆鼠造模成功[4]。然后将造模成功大鼠随机分成模型组9只、脑复康组8只、醒脑丸低剂量组9只、醒脑丸中剂量组9只、醒脑丸高剂量组9只，脑复康组给予脑复康溶液84 mg/kg灌胃，醒脑丸低、中、高剂量组分别给予醒脑丸水溶液0.21 g/kg、0.42 g/kg、0.84 g/kg灌胃，正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃，均每天1次，3 mL/次，持续14 d。

1.4观测指标

1.4.1大鼠机体状态 主要观察大鼠活动频繁度、反应能力、饮食量等。

1.4.2大鼠学习记忆能力 末次灌胃后，通过Morris水迷宫[5]检测大鼠的学习能力。迷宫配置内径1.5 m、高0.5 m的圆槽，其中含有对应的玻璃平台，能够让动物实现攀爬。然后向圆槽中加水至30 cm深，温度控制在(25±2)℃，并将玻璃平台放置到某一象限中部水面下1 cm处，其中设有多个门窗等可以帮助大鼠判断位置。然后将大鼠放置到平台中30 s以适应环境，让大鼠于固定点处入水；计数大鼠从入水到登上平台的全部时间即EL及游泳总路程。

1.4.3大鼠脑组织LD、Glu含量 水迷宫试验后，每组随机挑选8只脱臼处死，迅速取出脑组织，称质量后以1 g脑组织加入10 mL生理盐水的比例进行匀浆，3 000 r/min离心10 min后采集上清液并存储于-20 ℃冰箱中。用化学比色法测定脑组织中Glu及LD的含量，严格按照试剂盒操作说明进行测定。

2 结 果

2.1各组大鼠机体状态 手术造模前大鼠基本上都能够正常饮食与活动，手术完成后，大鼠均出现饮食减少、活动频率降低的表现；灌胃过程中模型组死亡1只。灌胃14d后，各给药组大鼠的上述表现均有所缓解，而模型组大鼠没有任何改变。

2.2各组大鼠学习记忆能力比较 模型组大鼠EL和游泳总路程均明显高于正常组(P均<0.05)，各给药组EL和游泳总路程均明显低于模型组(P均<0.05)，且脑复康组、醒脑丸中剂量组、醒脑丸高剂量组均低于醒脑丸低剂量组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠学习记忆能力比较

注:①与正常组比较，P<0.05;②与模型组比较，P<0.05；③与醒脑丸低剂量组比较，P<0.05。

2.3各组大鼠脑组织中Glu和LD含量比较 模型组大鼠脑组织中Glu、LD含量均明显高于正常组(P均<0.05)；各给药组Glu、LD含量均明显低于模型组(P均<0.05)，且脑复康组、醒脑丸中剂量组、醒脑丸高剂量组含量均低于醒脑丸低剂量组(P均<0.05)。 见表2。

表2 各组大鼠脑组织中Glu和LD含量比较

注:①与正常组比较，P<0.05;②与模型组比较，P<0.05；③与醒脑丸低剂量组比较，P<0.05。

3 讨 论

VD是痴呆类型中唯一可以预防与治疗的疾病，但目前尚无特效治疗药物。该病多由脑血管病变引起，与年龄、种族、动脉硬化等因素有关[6]。近年来研究发现，脑缺血和缺血后再灌注能引起脑能量耗竭，兴奋性氨基酸(EAA)释放增加，产生大量自由基，引起脂质过氧化反应，导致细胞肿胀、凋亡和坏死等[7]。兴奋性氨基酸包括Glu和天门冬氨酸，其中Glu是脑内正常的兴奋性神经递质，在介导突触兴奋性活动和突触可塑性等方面起着重要的作用，同时其也是一种潜在的神经毒性物质，可直接导致神经元坏死及凋亡。Glu系统和学习记忆有关,阻断Glu受体能够对神经元起到保护作用[8]。LD在脑组织中的富集主要是由脑缺血造成的，脑组织内酸性增高，会损伤正常的神经元，并且可能加速自由基的产生、加快脂质过氧化过程，最终对脑细胞造成不可逆的损伤[9-10]，尽快清除脑组织中过多的LD有助于保护脑细胞。

VD属于中医“痴呆”“健忘”“癫狂”等范畴，其病位虽在脑，但涉及肝、肾、心、脾，为本虚标实证。VD多发生于40 岁以上之人，而中年以后五脏之气渐衰，功能低下，脏气不足则阴精不生,营血不化，阴血不布，使脑乏清阳之助、津血之濡，脑髓失养，神明失用，日久则精髓逐渐枯萎，不能支配全身的运动和感觉，出现健忘、语言颠倒、行为古怪、失认失算、麻木不仁等痴呆症状，故气血亏虚是VD的病理基础。而气与血生理上密切联系，若气虚无力推动血液运行，必然导致瘀血阻络，故瘀阻脑络是VD的发病关键。此外，脑正常功能的维持离不开机体的分清别浊功能，同时必须保证无瘀血阻滞脑络，保证脑髓得到充足的血液和氧气供应，因此该病治疗关键是益气活血、醒脑开窍。醒脑丸即基于上述理论所制，方中黄芪具有较强的补气作用，使气旺以促血行，从而消除瘀血，且其可提高脑对缺氧耐受力，降低脑组织耗氧量[11]；西洋参同人参功效类似，有较好的补气功能，但不会损伤阴气，且其活性成分人参皂苷Rg2可增强大鼠学习和记忆能力[12]；当归活血养血，能有效祛除瘀血；川芎作为血中之气药，能有效消散瘀血；三七粉具有活血止血功效，能行血而不溢于脉外；地龙和水蛭破血逐瘀而不会损伤人体正气；何首乌能补益肝肾、益智安神；远志和菖蒲具有安神、化痰开窍功效，其中石菖蒲挥发油有抑制大鼠神经细胞凋亡的作用[13],可降低大鼠脑组织兴奋性氨基酸的含量, 保护脑细胞, 对痴呆大鼠学习记忆具有改善作用[14-15]。上述药物配合使用，具有醒脑开窍、益气活血功效，加之部分药物具有化痰作用，能消散瘀血，补气养血，改善机体功能。

本研究结果发现，模型组大鼠学习能力明显低于正常组，各给药组大鼠的学习能力明显高于模型组。模型组大鼠脑组织中LD、Glu含量明显高于正常组，各给药组大鼠脑组织中LD、Glu含量明显低于模型组。说明VD大鼠脑组织的变化与兴奋性氨基酸中毒学说的描述一致，存在脑组织血液和氧气供应不足，而醒脑丸可改善大鼠的学习记忆能力，有效避免脑细胞受兴奋性氨基酸的损害，可有效改善脑组织慢性缺氧状态。推测醒脑丸治疗VD的机制如下：①脑组织血液和氧气供应不足时，醒脑丸能阻碍兴奋性氨基酸的作用，减少Glu在缺血组织的堆积。②醒脑丸可能对Glu、LD的生成具有抑制作用，减少二者在脑组织中的含量，进而发挥对脑细胞的保护作用。

综上所述，醒脑丸能够改善VD大鼠的学习记忆能力，其作用可能是通过降低脑组织中Glu及LD含量实现的，这为后续对醒脑丸的作用机制研究提出了思路和方向。

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Effect of Xingnao Pill on glutamic acid and lactic acid content of cerebral tissue in vascular dementia rat

CHEN Jie1, TAO Genyu2

(1. Shaanxi TCM Hospital, Xi’an 710003, Shaanxi, China; 2. Shaanxi University of TCM, Xianyang 712000, Shaanxi, China)

Objective It is to investigate the influence of Xingnao Pill on glutamic acid and lactic acid content of cerebral tissue in vascular dementia rat. Methods Sity rats were randomly selected 8 cases into normal group, the others were duplicated models of vascular dementia rats with the operation of ligating bilateral carotids, and then divided into model group, Naofu Kang group, low-dose Xingnao Pill group, medium-dose Xingnao Pill group, high-dose Xingnao Pill group. At the thirty-fifth day after operation, the animals were treated with Naofu Kang 84 mg/kg gavage in Naofu Kang group, and with Xingnao Pill water solution 0.21, 0.42 and 0.84 g/kg gavage in low-, medium-and high-dose Xingnao Pill group, same amount of normal saline were gavage in normal group and model group, once a day for fourteen days. At the last day of treatment, the behavior experiment of rats were executed, then the glutamic acid and lactic acid content of cerebral tissue in rats were determined. Results The learning and memory ability of rats in the model group was obviously decreased than that in the normal group (P<0.01), the Learning and memory ability of rats in the groups with drug were improved than that in the modle group (allP<0.05). The levels of glutamic acid and lactic acid in cerebral tissue of rat in model group was markedly higher than that in the blank group (P<0.01), and that in each medical group was lower than that in model group (allP<0.05). Conclusion Xingnao Pill could treat vascular dementia by reducing glutamic acid and lactic acid content in cerebral tissue.

Xingnao Pill; vascular dementia; glutamic acid; lactic acid

陈杰，男，中医内科学博士后，主治中医师，研究方向为脑血管病临床与基础研究。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.36.008

R-332

A

1008-8849(2015)36-4014-03

2015-07-05