Livin、Survivin、Fas、FasL在胃癌中的表达及相关性研究

曹晓静，宋晓翠，杜丽艳，杨德志，马 超，宋晓昕，杨文霞

(河北省邢台市第一医院，河北 邢台 054001)

Livin、Survivin、Fas、FasL在胃癌中的表达及相关性研究

曹晓静，宋晓翠，杜丽艳，杨德志，马 超，宋晓昕，杨文霞

(河北省邢台市第一医院，河北 邢台 054001)

目的探讨Livin、Survivin、Fas、FasL在胃癌组织中的表达情况及与临床病理特征的关系。方法采用免疫组化SP法检测11例正常胃黏膜组织和102例胃癌组织中Livin、Survivin、Fas、FasL的表达情况，分析各指标表达情况与胃癌临床病理特征的关系。结果胃癌组织中Livin、Survivin和FasL的阳性表达率显著高于正常胃黏膜组织(P均<0.05)，Fas的阳性表达率显著低于正常胃黏膜组织(P<0.05)。Livin的表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移密切相关(P均<0.05)，Survivin的表达和肿瘤分化程度明显相关 (P<0.05)，而Fas和FasL的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、部位、浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期均无明显相关性(P均>0.05)。胃癌组织中Livin和Survivin的表达与Fas、FasL表达无明显相关性(P>0.05)。结论Livin、Survivin在胃癌组织中高表达，参与抑制细胞凋亡，与胃癌发生、发展密切相关，为胃癌的治疗提供了新的途径和方向。

胃癌；免疫组化；Livin；Survivin；Fas；FasL

胃癌在全世界很多国家的发病率都很高，极大危害了人类的健康。在中国每年都有很多的新发胃癌患者，因此胃癌的研究是我国医务人员需要面对的重要问题。导致胃癌发生的危险因素有很多，胃癌细胞凋亡机制受到抑制是肿瘤发生发展的一个重要促进因素。目前研究认为，凋亡抑制蛋白家族(IAPs)、Caspase家族、死亡受体(Fas)和配体(FasL)、BCL-2J家族等均可参与凋亡的调节，IAP家族有8个成员，其中抗凋亡作用较强的有Survivin和Livin[1]。近年来，消化系统肿瘤中Livin和Survivin的研究已经取得了明显进展[2]，但在胃癌中和Fas、FasL关系的研究不多。本研究检测了Livin、Survivin、Fas、FasL在胃癌组织中的表达情况，并分析各指标与临床病理特征的关系，旨在为胃癌的综合治疗提供新的途径和方向。

1 临床资料

1.1一般资料 选取2010年6月—2012年6月经手术切除胃癌组织标本102例作为胃癌组，男64例，女38例；年龄25～81岁，中位年龄58岁；有淋巴结转移76例，无淋巴结转移26例；肿瘤组织标本直径<5 cm 46例，≥5 cm 56例；肿瘤浸润深度为T1、T2共37例， T3、T4共65例；高分化、中分化共31例，低分化、未分化共71例；UICC分期：Ⅰ～Ⅱ期35例，Ⅲ～Ⅳ期67例。另选取11例癌旁正常胃黏膜组织标本作为正常组。患者均有完整的临床资料，术前未接受放化疗，标本均经HE染色病理证实。

1.2实验试剂 Livin兔抗人多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，Survivin兔抗人多克隆抗体购自Zemet公司，Fas兔多克隆抗体和FasL兔多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司,实验中应用的工作试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。

1.3实验方法 术后立即取材，以10%福尔马林液固定2～3 d。然后脱水固定，标本常规石蜡包埋。蜡块4 μm连续切片，贴于预先涂有APES的载玻片上，56 ℃烘烤24 h备用。切片经二甲苯脱蜡、自来水冲洗，以3%过氧化氢溶液室温(15～20 ℃) 孵育15 min以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗组织切片置于枸橼酸盐缓冲液(0.1 mmol/L，pH 6.0)中，用微波炉加热并保持92～98 ℃ 15 min，行抗原修复。滴加适当比例稀释的一抗，工作浓度Livin为1∶50，Survivin为1∶50，Fas为1∶400,FasL为1∶400。以PBS溶液代替一抗做空白对照。滴加生物素标记的二抗、滴加辣根酶标记链酶卵白素。DAB显色，显微镜下观察统一控制显色时间，终止显色封片。采用Olympus BX51型光学显微镜观察并摄片。

1.4结果判断标准 由2位经验丰富的病理科医生双盲阅片。根据实验中免疫组化显色深度和阳性细胞数量所占百分比进行半定量积分评估，每例标本每个观测指标在显微镜下随机抽取5个高倍视野(×400)。显色度记分标准：不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞数量所占百分比记分标准：阳性细胞数≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。两项指标分数相乘为最后得分，0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性(),9～12分为强阳性()。

1.5统计学方法 应用统计软件包SPSS 17.0进行统计处理，计数资料比较采用2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1Livin、Survivin、Fas、FasL镜下表达情况 Livin蛋白主要表达于胃癌细胞的细胞质和细胞核,显示为棕黄色颗粒，见图1；Livin蛋白在正常胃黏膜组织表达为阴性，见图2；Survivin蛋白主要表达于胃癌细胞的细胞质,表现为棕黄色颗粒，见图3；Survivin蛋白在正常胃黏膜组织表达为阴性，见图4；Fas、FasL蛋白阳性着色定位于细胞膜和细胞质,表现为棕黄色颗粒，而在正常胃黏膜组织无明显表达，见图5～8。

2.2Livin、Survivin、Fas、FasL阳性表达情况 胃癌组Livin、Survivin、FasL阳性表达率均明显高于正常组(P均<0.05)，Fas阳性表达率明显低于正常组(P<0.05)。见表1。

2.3胃癌组Livin、Survivin、Fas、FasL表达情况与临床病理因素的关系 Livin的表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移有相关性(P均<0.05)，但与患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤浸润深度及TNM分期无明显相关性(P均>0.05)。Survivin的表达和肿瘤分化程度明显相关(P<0.05)，但与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤浸润深度及TNM分期无明显相关性(P均>0.05)。Fas和FasL的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、部位、浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期均无明显相关性(P均>0.05)。见表2。

图1 Livin在胃癌组织的表达情况(SP×400)

图2 Livin在正常胃黏膜组织的表达情况(SP×400)

图3 Survivin在胃癌组织的表达情况(SP×400)

图4 Survivin在正常胃黏膜组织的表达情况(SP×400)

图5 Fas在胃癌组织的表达情况(SP×400)

图6 Fas在正常胃黏膜组织的表达情况(SP×400)

图7 FasL在胃癌组织的表达情况(SP×400)

图8 FasL在正常胃黏膜组织的表达情况(SP×400)

表 1 Livin、Survivin、Fas、FasL阳性表达情况 例(%)

注：①与正常组比较，P<0.05。

2.4胃癌组Livin、Survivin与Fas、FasL表达的相关性 胃癌组织中Livin、Survivin表达与Fas、FasL 表达无明显相关关系(P均>0.05) 。见表3。

3 讨 论

细胞凋亡异常在许多人类恶性肿瘤的发生发展中起着重要的作用。如果细胞凋亡受到抑制，细胞增殖与凋亡的平衡被破坏，将导致细胞数目不断增加，表现出生长趋势，这是肿瘤形成的一个重要基础。目前对凋亡抑制蛋白家族的结构研究比较清楚，其共同特点为N端含有杆状病毒IAP重复序列(baculovirus IAP repeat,BIR)，C端含有或不含有一个环指(ring finger)结构，其中BIR结构为抑制细胞凋亡的主要结构。该家族中Livin的抗凋亡途径主要有3个调控途径：①Caspase信号途径，Livin间接或直接与Caspase-3, 7, 9结合，发挥抑制细胞凋亡功能[3]；②激活TAK1/JNK1信号转导途径，减少细胞凋亡[4]；③Livin和Smac/DLABLO还可以相互制约，调控细胞凋亡[5]。在许多恶性肿瘤如消化道肿瘤(胃癌、结直肠癌、肝癌、食管癌)、泌尿系肿瘤(肾癌、膀胱癌、前列腺癌)、神经母细胞瘤、血液系统肿瘤等中Livin均呈高表达状态[6-11]，其高表达可能干扰了细胞分化、增殖与凋亡的平衡，抑制肿瘤细胞凋亡，使恶性转化的细胞数量异常增多，从而发生、发展为恶性肿瘤。而Survivin作用途径为：①直接或间接和Caspase-3,7结合，发挥抗细胞凋亡作用；②参与细胞增殖、分裂过程和细胞周期的调控；③参与肿瘤中血管形成从而抑制细胞凋亡。而Fas/FasL途径诱导的细胞凋亡目前比较清楚，即细胞膜上的Fas受体和FasL的结合能启动细胞凋亡。

表2 胃癌组织中Livin、Survivin、Fas、FasL表达情况与临床病理因素的关系 例

表3 Livin、Survivin和 Fas、 FasL表达相关性 例

本研究结果显示，在胃癌组织中Livin、Survivin明显高表达，而在正常胃组织中几乎不表达，与文献[12-13]报道基本一致；胃癌组织中Livin的表达与肿瘤组织分化程度及淋巴结转移有显著相关性，而与患者年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤浸润深度及TNM分期无明显相关性，提示Livin表达程度越高其肿瘤恶性度越高，表现为组织分化程度低和淋巴结转移可能性大；Survivin的表达与肿瘤组织分化程度明显相关，但与患者年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤浸润深度、有无淋巴结转及TNM分期无明显相关性，提示Survivin的高表达可能抑制了肿瘤细胞凋亡，破坏了肿瘤细胞分化、增殖与凋亡之间的平衡，导致肿瘤的进展。在胃癌组织中FasL明显高表达，Fas明显低表达，提示在胃癌的发生发展中存在着Fas、FasL的表达失衡,Fas/FasL系统的平衡失调可能是胃黏膜癌变过程中细胞凋亡抑制的重要机制之一，推测Fas/FasL系统介导的细胞凋亡与胃癌的形成密切相关。本研究进一步分析了Livin和Survivin表达与Fas、FasL的相关性，未发现Livin、Survivin与Fas、FasL之间存在明显相关性，说明在胃癌组织中，Livin、Survivin抑制细胞凋亡作用和Fas/FasL途径诱导细胞凋亡没有关联。

综上所述，Livin、Survivin在胃癌组织中高表达，参与抑制细胞凋亡，与胃癌发生、发展密切相关，为胃癌的治疗提供了新的途径和方向。但该如何具体诱导肿瘤细胞的凋亡过程，能否通过抑制 Livin、Survivin的表达而恢复肿瘤细胞正常凋亡过程，从而抑制肿瘤的发生、发展还有待继续研究。

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Study on the relationgship and the expression of Livin, Survivin and Fas/FasL in gastric carcinoma

CAO Xiaojing, SONG Xiaocui, DU Liyan, YANG Dezhi, MA Chao, SONG Xiaoxin, YANG Wenxia

(The First Hospital of Xingtai, Xingtai 054001, Hebei, China)

Objective It is to investigate the expression of Livin, Survivin, Fas and FasL in gastric carcinoma and the correlation with the clinical pathological features. Methods The expressions of Livin, Survivin, Fas and FasL were detected by immunohistochemical SP method in 102 cases of gastric carcinomas and 11 cases of human normal gastric tissues, then the expression of them and the correlation with clinical pathological features were analyzed. Results The expressions of Livin, Survivin and FasL in gastric carcinoma were significantly higher than that in normal gastric tissues (allP<0.05). The expression of Fas in gastric carcinoma was significantly lower than that in normal gastric tissues (P<0.05). Livin positive expression was significantly associated with degrees of differentiation and lymphatic metastasis (allP<0.05). Surviving expression was significantly correlated with the degree of tumor differentiation (P<0.05). And the expression of Fas and FasL had no significant correlation with age, gender, tumor size, location, depth of invasion, lymph node metastasis, distant metastasis and TNM staging (allP>0.05). There was no significant correlation between Livin, Survivin and Fas, Fasl in human gastric carcinoma (P>0.05). Conclusion Livin, Survivin are high expression in gastric carcinoma, they participate in the inhibition of cell apoptosis and closely relate with gastric carcinoma development and progression. This will provide a new strategy and direction for gastric carcinoma targeted therapy.

gastric carcinoma; immunhistochemistry; Livin; Survivin; Fas; FasL

曹晓静，女，硕士，主治医师，主要从事胃肠肿瘤外科工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.36.006

R735.2

A

1008-8849(2015)36-4006-04

2015-06-01