麻枳降浊方对便秘型肠易激大鼠肠组织中5-HT、MC影响的实验研究

杨 倩，刘建平，郎晓猛，邱 贝，杜 姚，郭子敬，张云凤

(河北省中医院，河北 石家庄 050011)

论 著

麻枳降浊方对便秘型肠易激大鼠肠组织中5-HT、MC影响的实验研究

杨 倩，刘建平，郎晓猛，邱 贝，杜 姚，郭子敬，张云凤

(河北省中医院，河北 石家庄 050011)

目的观察麻枳降浊方干预前后便秘型肠易激综合征大鼠肠组织中5-羟色胺(5-HT)及肥大细胞(MC)水平，探讨该方治疗便秘型肠易激综合征的可能作用机制及作用靶点。方法将60只雄性 Wistar 大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药物组及麻枳降浊方高、中、低剂量组，各组大鼠正常饲养，不限食水，除正常组外各组均通过冰水灌胃法建立便秘型肠易激综合征大鼠模型，模型建立后，阳性药物组给予西沙必利3.6 mg/(kg·d)灌胃，麻枳降浊方高、中、低剂量组分别给予麻枳降浊方颗粒剂25.2 g/(kg·d)、12.6 g/(kg·d)、6.3 g/(kg·d)灌胃，模型组给予常温蒸馏水灌胃。肉眼观察大鼠的一般情况。灌胃14 d后处死大鼠，采用免疫组织化学法检测大鼠肠道组织中 5-HT 表达水平，甲苯胺蓝改良法染色后观察大鼠肠道组织内MC计数。结果与模型组相比，各给药组大鼠一般情况明显好转，肠道组织中 5-HT 表达水平显著下降(P<0.05)， MC计数明显减少(P<0.05)。结论麻枳降浊方可能通过降低肠道组织中5-HT 的表达、减少MC 的数量，从而改善肠道敏感性及动力异常，起到治疗便秘型肠易激综合征的作用。

麻枳降浊方；便秘型肠易激综合征；5-HT；肥大细胞

便秘型肠易激综合征(constipation predominant irritable bowel syndrome ，IBS-C)是临床上常见的一种以便秘为主症的肠道功能性疾病，其病理生理学基础主要是胃肠动力学及内脏感觉异常，表现为以便秘为主症的肠功能紊乱性疾病，虽然肠道无器质性病变，但整个肠道对刺激的生理反应有过度或反常现象[1]。本研究通过冰水灌胃法[2]建立 IBS-C大鼠模型，以麻枳降浊方对模型进行干预性治疗，采用西沙必利片进行阳性药物对照，观察大鼠肠组织中5-羟色胺(5-HT)表达水平及肥大细胞(mast cell,MC)个数的变化，探讨麻枳降浊方对 IBS-C 的治疗作用及其可能机制，旨在为临床治疗IBS-C提供理论依据。

1 实验资料

1.1药物及试剂 麻枳降浊方由麸炒枳实(0.7 g/袋，批号：1111073，相当于饮片6 g)、女贞子(2.3 g/袋，批号：1111203，相当于饮片10 g)、旱莲草(0.7 g/袋，批号：1108155，相当于饮片10 g)、火麻仁(2.0 g/袋，批号：1108215，相当于饮片10 g)组成，以上颗粒剂由广东一方制药有限公司提供。西沙必利片(西安杨森制药有限公司生产，批号：9801316)。兔免疫组化试剂盒(PK-4001北京博奥森生物科技有限公司)。

1.2动物及模型制备 选取60只清洁级雄性 Wistar 大鼠，体质量(140±20)g，由河北医科大学试验动物中心提供(冀医动管字 1202182号)，适应性喂养 1 周，观察大鼠粪便形态和含水量，均为正常者用于实验。将Wistar大鼠采用随机数字表法分为正常组10只和造模组50只，2组大鼠均不限食水，正常饲养。造模组每日8:30给予大鼠冰水混合物(生理盐水)灌胃造模14 d， 以大鼠粪便质硬、形态变小、含水量减少为造模成功标准；造模期间1只大鼠逃逸，1只大鼠出现腹泻，共有48只大鼠成功建立模型，造模成功率为98%。

1.3分组及给药 将造模成功大鼠采用随机数字表法分为模型组9只、阳性药物组10只、麻枳降浊方高剂量组10只、麻枳降浊方中剂量组10只、麻枳降浊方低剂量组9只，各给药组药物剂量按体表面积换算[3]，阳性药物组给予西沙必利3.6 mg/(kg·d)灌胃，麻枳降浊方高、中、低剂量组分别给予麻枳降浊方颗粒剂25.2 g/(kg·d)、12.6 g/(kg·d)、6.3 g/(kg·d)灌胃，模型组给予等量蒸馏水灌胃，正常组10只正常饲养。于第2周末采用断头取血法处死大鼠，取出全胃肠组织，测量小肠推进比。取各组大鼠的回盲部、结肠(距肛门5 cm)、小肠(距回盲部5 cm)各 0.5 cm，生理盐水冲洗，固定液固定。

1.4观测指标

1.4.1肉眼观察 通过肉眼观察造模前后大鼠的精神状态、进食量、毛色光泽程度、粪便形态及体质量变化等。

1.4.2大鼠肠道组织中5-HT表达情况 肠道组织标本用 10%中性甲醛固定液固定，脱水后常规蜡块包埋，制作4 μm 厚石蜡切片，按照 SP 免疫组化试剂盒要求操作，以PBS代替一抗作为阴性对照。肠组织切片出现特异性的棕黄色颗粒为阳性，提示有5-HT表达；在低倍视野(×100)下观察反应情况，每张切片观察4个视野，利用HMIAS-2000彩色图文分析系统分析阳性的平均光度值。

1.4.3大鼠肠道组织中MC数量 取各组大鼠的回盲部和结肠的石蜡切片，采用甲苯胺蓝改良染色法[4-6]染色后，每张每部位取 3 张，每例切片随机选取3个视野，在400倍OlymPus-BX60光学显微镜下计数MC个数。

1.5统计学方法 采用SPSS 16.0 软件进行统计分析，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK法，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠一般状况 正常组大鼠精神良好，粪便呈黄褐色麦粒状，长约0.9 cm，质地较软，易掰开，尿量正常。模型组大鼠精神可，毛色较正常组无光泽，粪便多呈灰褐色或灰白色小黄豆状，可与麦粒状粪便夹杂相见，长0.4～0.6 cm，质地稍硬，个别不能掰开，尿量正常。

2.2各组大鼠肠道组织病理变化 HE染色显示各组大鼠结肠、小肠及回盲部肠组织结构完整，未见充血、水肿、糜烂等病理改变。光镜下5-HT阳性细胞主要集中在肠道黏膜上皮层、黏膜层腺体及肠肌间神经丛，黏膜层5-HT阳性细胞呈腺管样排列，散布于腺管之间及黏膜下层，胞浆呈棕黄色至褐色。光镜下观察肠组织切片中MC呈散在分布，圆形、椭圆形等；部分MC呈脱颗粒状态，细胞呈不规则形，其脱颗粒散布于细胞膜的周围；部分MC未见脱颗粒状态，其细胞形态规则且细胞膜及细胞质未见异常变化。MC主要分布在黏膜下层以及黏膜固有层内；细胞质被甲苯胺蓝染成紫红色，细胞核为蓝色，部分细胞中胞质呈现紫红色分布不均，考虑可能与染色过程中乙醇分色时间把握不恰当有关。

2.3各组大鼠肠道组织中5-HT表达情况 模型组大鼠肠道各部位组织中5-HT阳性表达水平均明显高于正常组(P均<0.05)，各给药组5-HT阳性表达水平均明显低于模型组(P均<0.05)，麻枳降浊方高、中剂量组5-HT阳性表达水平均明显低于阳性药物组(P均<0.05)。见表 1。

表1 各组大鼠肠道组织切片光度值比较

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与阳性药物组比较，P<0.05。

2.4各组大鼠肠道组织中MC计数比较 模型组大鼠肠道各部位组织中MC计数均明显高于正常组(P均<0.05)，各给药组MC明显多于模型组(P均<0.05)，各给药组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

3 讨 论

随着对 IBS-C 发病机制的研究逐渐深入，发现该病发生与以下机制有关：①胃肠动力学。Manabe等[7]提出 IBS-C患者肠道平滑肌运动障碍导致结肠蠕动速度明显减慢。②内脏感觉异常。邹多武等[8-9]研究证实IBS-C患者存在内脏感觉异常。③感染相关机制。贺星等[10]研究提出导致疾病发生的主要原因可能是肠道感染破坏肠黏膜屏障以及脑-肠轴，或者细菌滋生。④神经-免疫-内分泌网络调控机制。杨云生[11]在总结前人对IBS发病机制的基础上，创新性地提出了“神经-免疫-内分泌网络调控机制”。⑤其他因素[12-13]，如社会因素以及个人心理因素、饮食因素。

表2 各组大鼠肠道组织中MC计数比较，个)

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

5-HT是一种广泛分布的神经递质，具有调节消化道功能的作用，几乎参与所有IBS的病理生理过程[14]。胃肠道腺腔底部的神经内分泌细胞(endocrinecell,EC)主要合成、分泌并再摄取外周神经系统的5-HT，某些病理性刺激(如缺血、应激)及生理性刺激(如进食、扩张)可促使神经内分泌细胞释放5-HT。5-HT的增加一方面提高了内脏神经系统的高敏性，激活了多种神经活性物质，使参与脑-肠调节的化学信号异常表达，另一方面5-HT与其各种受体结合作用于患者的肠道感知、运动及分泌系统，从而产生了各种临床症状[15]。由此可见， 5-HT在IBS-C的发病中具有重要意义。

伴随“免疫-神经-内分泌网络”理论的提出，MC在此理论中也受到了更多的关注。神经系统功能、胃肠道感觉和运动等都与MC有不同程度的关系。MC存在于人体的结缔组织内，其中血管、淋巴以及神经周围分布较为广泛，其在变态反应、防御性免疫反应及免疫调节中起到了重要作用[16]。MC功能主要依靠“脱颗粒”的形式实现，可释放包括组胺、5-HT、白细胞介素等在内的多种递质[17]。在IBS-C发病过程中，MC扮演着极为重要的角色，当MC受到非免疫性或/和免疫性刺激时被激活，从而释放多种具有生物活性的递质导致疾病的发生及发展[18]。李兆申等[19]研究发现MC稳定剂或MC产物拮抗剂可能存在治疗作用。王伟岸等[20]的临床观察及动物实验研究证实MC参与IBS内脏高敏感形成。故认为对MC的研究是攻克IBS的重要途径。目前现代医学治疗较为局限，多为对症治疗，应用缓泻剂、促进胃肠动力剂、解痉止痛剂以及抗焦虑抑郁等药物，但会出现腹泻、电解质紊乱等，长期服用会出现药物耐受和依赖性。

中医中并没有IBS-C病名的记载，根据其腹痛及便秘的症状，属“便秘”“郁证”“腹痛”等范畴，“脾约”“不更衣”“阴结”“阳结”等也与IBS-C相关。对于IBS-C的中医病因病机大致包括情志内伤、外邪入里生毒、内生毒邪、肝肾阴虚、肠燥热结、肺气郁闭，瘀血内停等。在李佃贵教授“浊毒”理论[21]的基础上，结合笔者多年临床经验，认为IBS-C发病的基本病机为浊毒内蕴致大肠传导失司，病位在大肠，与肝、脾、肾关系密切，“浊毒”既是致病原因，同时也是病理基础。浊毒或因外邪六淫入里，或因内邪郁久化毒等多种因素聚集，浊毒乃成。浊毒在肺，伤及华盖之气，宣降失常，“肺与大肠相表里”，病机传变致大肠传导失司；浊毒在肝，肝失条达，气机升降失常，或因肝气横逆犯脾，肝脾不和，脾失健运，传化失常；浊毒在肾，“肾司二便”功能失职，均导致糟粕内停，大便难，从而导致本病发生。因此以降浊解毒、补益肝肾大法总结出经验方——麻枳降浊方治疗。该方以火麻仁及枳实入脾、胃、大肠经，女贞子、墨旱莲皆入肝、肾经。重用火麻仁润肠通便解毒为君药，且兼具滋养之功；枳实理气消积降浊，为臣药，且能在恢复“脾升胃降”的同时兼消肠道之积；女贞子、墨旱莲为中医名方二至丸，滋补肝肾治其本，兼有“舟车”之义。全方攻中寓补，攻补兼施，共奏疏肝理脾、补益肝肾、润肠通便之功。

本研究以5-HT、MC在肠道组织中的表达为切入点，观察了麻枳降浊方对IBS-C的治疗作用及作用机制。实验结果显示，肠道组织中5-HT的表达水平模型组明显高于正常组，大鼠回盲部及结肠组织中MC计数明显多于正常组，可见5-HT、MC与IBS-C发生密切相关；麻枳降浊方各剂量组5-HT表达水平及MC计数均较模型组明显降低，提示麻枳降浊方可有效抑制5-HT在肠道组织中的表达以及减少回盲部及结肠组织的MC计数。故推测麻枳降浊方可能通过降低大鼠肠道组织中5-HT的表达、减少MC的数量，从而改善肠道敏感性及动力异常，起到治疗IBS-C的作用。

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Experimental study on the influence of Mazhi Jiangzhuo Prescription on 5-HT, MC in the intestinal tissueof rat with constipation predominant irritable bowel syndrome

YANG Qian, LIU Jianping, LANG Xiaomeng, QIU Bei, DU Yao, GUO Zijing, ZHANG Yunfeng

(HeBei Provincial Hospital of TCM, Shijiazhuang 050011, HeBei, China)

Objective It is to observe the influence of Mazhi Jiangzhuo Prescription (MZJZP) on the 5-HT and number of the mast cell in the rats with constipation predominant irritable bowel syndrome(IBS-C), and explore the possible mechanism of this method in treating IBS-C and its potential target. Methods Sixty Wistar rats were randomly divided into normal group, model group, positive drug group and MZJZP high, medium, low dose groups, normal feeding, not limited to fresh wate. Except the normal group, the rat model of IBS-C in other groups were establish by gavage with icy water for 2 weeks. Then the rats were treated with Cisapride in the positive drug group, MZJZP of 25.2, 12.6 and 6.3 g/(kg·d) in the MZJZP high, medium and low dose groups, and distilled wate in the model group. The general condition of rats was observed by the naked eye. After 14 days of treatment the rats were killed to observed the mast cell count in the rats of intestinal tissue by HE method, and the level of 5-HT by immunohistochemistry. Results Compared with the model group, the other rats with IBS-C were significantly improved in general, the expression of 5-HT was significantly decreased (P<0.05), and the mast cell count was markedly decrease in the intestinal tissue (P<0.05). Conclusion MZJZP maybe decreased the expression of 5-HT in the intestinal tissues, and reduce the number of MC, thereby improving the sensitivity and intestinal motility disorders to treat IBS-C.

Mazhi Jiangzhuo Prescription; constipation predominant irritable bowel syndrome; 5-hydroxytryptamine; mast cell

杨倩，女，主任医师,教授,硕士生导师，主要研究方向为中医消化系统疾病的诊治。

刘建平，E-mail：13603396653@163.com

河北省科技支撑计划项目(10246141D)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.36.001

R-332

A

1008-8849(2015)36-3991-04

2015-05-18