PI3K/Akt和MAPK信号通路在缺血性脑损伤中的保护作用

郁　迪(综述)，莫绪明(审校)

(南京医科大学附属南京儿童医院心胸外科,南京 210008)



PI3K/Akt和MAPK信号通路在缺血性脑损伤中的保护作用

郁迪△(综述)，莫绪明※(审校)

(南京医科大学附属南京儿童医院心胸外科,南京 210008)

摘要：磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是细胞内重要的信号转导通路。研究发现PI3K/Akt和MAPK信号通路经下游多种靶点，即内皮型一氧化氮合酶、糖原合成酶激酶3、核因子κB、细胞外信号调剂激酶等促进脑缺血后神经细胞的存活PI3K/Akt和MAPK这两条信号通路在缺血性脑损伤中发挥重要的作用，在一定条件下，这两条信号通路的激活可以通过上述途径有效抑制神经元细胞的凋亡而发挥脑保护的作用。

关键词：磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B；丝裂原活化蛋白激酶；脑保护；脑缺血；凋亡

深低温低流量体外转流方法是在深低温下保持一定的流量灌注以避免大脑处于持续缺血状态。这样既保证了大脑最低的氧代谢需求，防止脑细胞酸中毒；又能提供较清晰的手术视野，不影响复杂先天性心脏病的手术操作。由于深低温低流量本质上也是一个对大脑供血减少的过程，不可避免地会有缺血性脑损伤的存在，因此对于缺血性脑损伤的保护非常重要。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)通路是细胞内重要的信号转导通路，通过影响下游多个靶点而发挥抑制凋亡、促进增殖的作用。大量研究发现，其在脑缺血保护中也有重要作用[1-4]。现就PI3K/Akt和MAPK两条信号通路在缺血性脑损伤中抗凋亡作用的研究进展作一综述。

1PI3K/Akt信号通路

PI3K家族成员属于原癌基因，PI3K是由催化亚基p110和调节亚基p85构成的异源性二聚体。PI3K是一种可使肌醇环第三位羟基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶,激活后可磷酸化细胞膜上的肌醇,生成磷脂酰肌醇-3-磷酸、磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸。后两者通过与Akt的PH区结合,部分激活Akt,并使其转位于细胞膜的内表面。磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸可激活位于细胞膜内表面的磷脂酰激酶依赖激酶1、2，并进一步活化Akt。Akt可使丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)磷酸化，故又称Ser/Thr激酶。可活化多种下游途径，如内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)、核因子κB、Bad、caspase-9等，成为重要的抗凋亡因子。PI3K/Akt通路通过抑制细胞凋亡，使细胞存活，在缺血性脑损伤的保护中发挥重要作用。PI3K/Akt通路的具体机制如下。

1.1Akt/caspase途径caspase家族在介导细胞凋亡中起重要作用，主要有两种不同的途径：一种为caspase-8与CD95或肿瘤坏死因子受体1结合后介导的外源性途径；另一种为线粒体起始的内源性途径。细胞应激反应或凋亡信号能引起线粒体细胞色素C的释放，作为凋亡诱导因子，细胞色素C能与凋亡酶激活因子1、caspase-9前体、腺嘌呤核糖核苷酸/腺嘌呤脱氧核糖核苷酸形成凋亡体，然后召集并激活caspase-3，进而引起caspase级联反应，导致细胞凋亡[5]。细胞色素C从线粒体释放到细胞质中是线粒体介导的内源性凋亡途径的关键性步骤，而caspase-9的活化是该级联反应中的起始步骤。Akt促进细胞存活主要通过干预细胞凋亡级联反应的上游细胞色素C的释放,Akt能稳定线粒体的通透性转换孔以及抑制Bcl-2家族成员形成的线粒体跨膜通道，从而抑制细胞色素C从线粒体的释放[6-7]。并且活化的Akt使caspase-9在Ser196位点磷酸化而失活，从而抑制caspase-3等下游分子引起的一系列级联反应，达到抑制凋亡的目的。何晓敏等[8]研究也发现，通过抑制线粒体细胞色素C的释放可以发挥脑保护的作用。

1.2Akt/Bcl-2途径Bcl-2家族的表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一，在细胞凋亡信号转导途径中发挥重要作用。根据其在细胞凋亡调控中的不同作用，Bcl-2蛋白家族分为两大类：一类是抗凋亡蛋白，主要包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w和Mcl-1等；另一类是促凋亡蛋白，主要包括Bax、Bak、Bcl-x(s)和Bad等。缺血/缺氧刺激后可以激活PI3K，活化的PI3K激活Akt的磷酸化，活化的Akt使Bad在Ser136磷酸化，产生一个能与伴侣蛋白14-3-3结合的位点而形成复合物，一旦与伴侣蛋白14-3-3形成复合物后，Bad就从与Bcl-2或者Bcl-xL形成的异源二聚体中分离，使胞质中游离的Bcl-2或者Bcl-xL表达增加，而发挥抗凋亡作用[9-10]。同时活化的Akt可以上调Bcl-2的表达及下调Bax的表达，而发挥脑保护的作用[11]。通过基因剔除Akt小鼠的研究发现，缺血时Akt的磷酸化水平降低，使胞质中Bcl-2的表达下调而Bax的表达上调，促进脑细胞凋亡，脑损害加重[1]。

1.3Akt/GSK-3β途径GSK-3具有GSK-3α和GSK-3β两种亚型，GSK-3β高度表达于中枢神经系统并具有神经系统特异性，在促凋亡和促炎症反应中起重要作用。GSK-3β在细胞内活性受双位点磷酸化调控，在酪氨酸(Tyr)216磷酸化激活，GSK-3β在Tyr216去磷酸化或者在Ser9磷酸化而失活。在缺血刺激后，Akt首先通过Ser473磷酸化而激活，激活的Akt通过GSK-3βSer9的磷酸化而负性调节其活性，失活的GSK-3β可使环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element- binding protein,CREB)磷酸化而激活，活化的CREB可以调控一些生存因子的转录，如脑源性神经营养因子，从而减轻细胞凋亡[12]。研究发现，雌激素可以通过PI3K/Akt信号通路，增加缺血后脑组织中GSK-3β的磷酸化，而发挥抗凋亡作用[2]。

1.4Akt/叉头途径叉头转录因子家族成员的4个亚型(FKHR/FoxO1、FoxO2、FKHRL1/FoxO3和AFX/FoxO4)均能被Akt直接磷酸化，磷酸化的插头蛋白可以调控其靶基因促进细胞存活。生存因子可以活化PI3K/Akt途径，激活的Akt进入细胞核使FKHRL1/FoxO3在Thr32和Ser253分别磷酸化，磷酸化的FKHRL1/FoxO3从胞核转位入胞质，并与伴侣蛋白14-3-3结合而存留在胞质中，抑制Bim(Bcl-2家族促凋亡蛋白中的一种)的表达和促进Bcl-6(可以负性调控抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达)的表达[13-14]。同时活化的Akt可以磷酸化插头转录因子，磷酸化的插头转录因子与14-3-3蛋白结合，不能转位进入细胞核而停留在胞质中，从而抑制Fas的活化和caspase级联反应的激活[15]。

1.5 Akt/核因子κB途径核因子κB在胞质中与抑制性卡巴蛋白形成无活性的复合物。活化的PI3K/Akt使抑制核因子κB激酶Thr 23磷酸化,从而激活核因子κB激酶，活化的核因子κB激酶又使核因子κB抑制剂(inhibitor of nuclear factor kappa-B,IκB)磷酸化，磷酸化的IκB使IκB和核因子κB形成的复合物构象发生改变，随后IκB从核因子κB上脱落，从而使核因子κB由抑制状态被激活，并通过转位进入细胞核，与DNA结合，启动有关抗凋亡基因的转录，如Bcl-2、Bcl-xL[16]、凋亡蛋白抑制因子和X性染色体连锁的凋亡蛋白抑制因子[17]。其中，Bcl-2和Bcl-xL可以抑制线粒体细胞色素C的释放，而凋亡蛋白抑制因子可以特异性地抑制caspase-3/7/9的活化而发挥抗凋亡效应。

1.6Akt/eNOS途径缺血/缺氧刺激后PI3K被激活，活化的PI3K导致Akt的磷酸化和eNOS的磷酸化，磷酸化的eNOS产生一氧化氮，而后者可以刺激鸟苷酸环化酶产生环磷酸鸟苷，高浓度的环磷酸鸟苷激活蛋白激酶G，最终导致线粒体ATP敏感性钾通道在线粒体内膜上的开放[18]。研究发现，预先给予线粒体ATP敏感性钾通道开放剂二氮嗪能显著降低细胞色素C和caspase-3蛋白水平，从而抑制线粒体凋亡通路，发挥脑保护作用[19]。

2MAPK信号通路

MAPK是细胞内的一类Ser/Thr激酶，在哺乳动物中已发现和克隆了细胞外信号调节激酶(extracellular signal regutated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-term inal kinase,JNK)/应激激活蛋白激酶(stress-activated protein kinase,SAPK)、p38/SAPK2和大丝裂素活化蛋白激酶14个MAPK亚族。每个MAPK亚家族由几种亚型和成员组成，且往往具有不同的功能。目前发现存在着多条并行的MAPK通路，不同的细胞外刺激可以激活不同的MAPK信号通路。

2.1ERK1/2通路生长因子与细胞膜上的受体酪氨酸激酶结合后，将信号传给Ras，Ras发生膜转位并激活Ser/Thr激酶Raf，后者是蛋白酪氨酸激酶受体信号转导的中心，活化的Raf通过磷酸化mitogen-activated protein kinase kinase 1/2 (MEK1/2)上的两个调节性Ser位点来激活MEK；MEK可以使Ser/Thr和Tyr磷酸化，最终高度选择性地激活ERK1/2，形成经典的Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号转导通路。ERK1/2活化后，作用于其主要的靶蛋白pp90核糖体S6激酶，后者可使Bad的Ser112磷酸化，磷酸化的Bad从与Bcl-2或Bcl-xL形成的异源二聚体中分离，并与伴侣蛋白14-3-3结合而失活[20]；同时Rsks也可使CREB在Ser133磷酸化，活化的CREB形成二聚体，募集CREB并与Bcl-2基因上的环磷酸腺苷反应元件结合，促进Bcl-2的转录[21-22]。通过这两条途径使Bcl-2家族中抗凋亡蛋白/促凋亡蛋白比值增加，而发挥抗凋亡效应。

2.2JNK/SAPK通路混合连接激酶(mixed-lineage kinases,MLKs)、mitogen-actiated protein kinases kinases kinases(MEKKs)、凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1)以及转化生长因子β激活性激酶1(transforming-growth factor β-activated kinase 1,TAK1)都可以磷酸化并激活MAPK激酶(mitogen-activated protein kinase kinases,MKKs)，即MKK4/7，而后者又高度特异性地激活JNK/SAPK。激活后的JNK进一步使核内的转录因子c-Jun的Ser63和Ser73磷酸化，进而激活c-Jun而增强其转录活性。此外，JNK/SAPK激活后还可以使转录因子Elk-1(Ser383和Ser389)和活化转录因子2(Thr69和Thr71)发生磷酸化，并使其转录活性增强。c-Jun、c-Fos、Elk-1和活化转录因子2以同或异二聚体的形式和许多基因启动子上的AP-1和AP-1样位点结合，提高AP-1的转录活性，促进基因的表达和蛋白质的合成。Dong等[23]发现，缺血损伤可以通过JNK/c-Jun/AP-1的通路使脑细胞中14-3-3γ的水平提高，而后者又可与磷酸化的Bad特异性结合以抑制其促凋亡的作用[24]。而Wang等[25]发现，MLK/MKK/JNK途径使JNK活化，激活的JNK可以促进Bcl-2和14-3-3蛋白的磷酸化，使Bax从Bax/Bcl-2及Bax/14-3-3的异源二聚体中游离，从而介导线粒体细胞色素C的释放，引起凋亡。

2.3p38MAPK通路激活p38的磷酸化级联反应与经典的MAPK的三级激酶反应相同，即细胞外信号启动细胞内的一系列反应(MLK3、MEKK4、ASK1和TAK1)，最终导致双位点特异激酶MEK/MKK(MEK3/6)磷酸化邻近的Tyr与Thr，激活p38MAPK通路。p38有4个同型异构体：p38α、p38β、p38γ和p38δ,在脑组织中仅有p38α和p38β的表达。研究表明，p38α可以通过与转化生长因子β激活的蛋白激酶1结合蛋白相互作用并自我磷酸化而激活[26]。活化的p38磷酸化并同时激活丝裂原和应激活化蛋白激酶1及丝裂原活化蛋白激酶活化蛋白激酶2，后两者可以进一步使CREB Ser133磷酸化，活化的CREB与Bcl-2基因上的环磷酸腺苷反应元件结合，促进Bcl-2的转录，而发挥抗凋亡效应。活化的p38 MAPK还可激活转录因子活化转录因子2及Elk-1，使其与CREB共同作用促进即刻早期基因转录增加，如c-fos。而c-fos在缺血性脑损伤中的作用还存在争议，部分学者认为c-fos基因在脑缺血过程中的表达可以上调神经生长因子基因的表达，从而发挥对神经细胞的保护作用，如张志琴等[27]研究发现c-fos对神经细胞的保护作用可能是通过对Bcl-2家族蛋白的间接调控而发挥作用。另有学者认为，c-fos的高度表达阻断了细胞内信号的转导，并产生死亡因子，最终导致缺血后神经细胞凋亡，如Hattori等[28]研究发现，抑制c-fos的表达，可部分阻断细胞凋亡，也验证了这一结果。c-fos基因的表达具有双重效应，它既参与对受损神经细胞的保护作用，又介导和诱导神经细胞凋亡。而c-fos表达发挥哪种效应，可能取决于细胞所处的内外环境、c-fos表达的数量及某些尚未发现的决定性因素。

3结语

随着复杂先天性心脏病手术的广泛开展，运用深低温低流量体外循环方法的手术不断增加，因此缺血性脑损伤的发生也随之增加。脑缺血损伤后，可以激活PI3K/Akt和MAPK信号通路，PI3K/Akt和MAPK信号通路之间存在着广泛的相互作用，在脑缺血性损伤的保护中不可能仅通过一条通路来达到脑保护的效果；并且在同一条通路中，也同时存在着促凋亡和抗凋亡两种不同的效应。因此如何在抗凋亡和促凋亡之间达到一个平衡点，并发挥脑保护的作用，仍然有待进一步的研究。

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Study on the Protection Effects of PI3K/Akt and MAPK Signal Pathways in Ischemic Brain InjuryYUDi,MOXu-ming. (DepartmentofCardiothoracicSurgery,NanjingChildren′sHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing210008,China)

Abstract:Phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B(PI3K/Akt) and mitogen-activated protein kinases(MAPK) signal pathways are important intracellular signaling transduction pathways.It has been reported that both of them could activate downstream targets,namely,endothelial nitric oxide synthase,glycogen synthase kinase3,nuclear factor-κB,extracellular signal regutated kinase,et al.to make the neurons survive after ischemia brain injury.Therefore,such findings indicate that PI3K/Akt and MAPK signal pathways play critical roles in ischemia brain injury.Under certain circumstances,activation of these two pathways can effectively inhibit apoptosis of neuronal cells through the above ways and play a protective role in ischemia brain injury.

Key words:Phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B; Mitogen-activated protein kinases; Cerebral protection; Cerebral ischemia; Apoptosis

收稿日期：2014-02-17修回日期：2014-07-08编辑：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.02.007

中图分类号：R742

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)02-0210-04