Netrin-1受体UNC5C广泛甲基化与大肠癌的相关性分析

孙冬生，贾凤杰，刘 宁，王 刚，李海洋，高春艳，王志钢

(1.河北省唐山市开滦总医院，河北 唐山 063000；2.内蒙古大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010021)

Netrin-1受体UNC5C广泛甲基化与大肠癌的相关性分析

孙冬生1，贾凤杰1，刘 宁1，王 刚1，李海洋1，高春艳1，王志钢2

(1.河北省唐山市开滦总医院，河北 唐山 063000；2.内蒙古大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010021)

目的探讨神经突起生长导向因子(Netrin-1)受体UNC5C广泛甲基化与大肠癌发生、发展的相关性。方法 使用结合重亚硫酸盐限制性内切酶法(COBRA)检测54例散发性大肠癌组织及其相关正常黏膜组织以及52例大肠腺瘤组织中UNC5C启动子的2个区域(区域1和区域2)中UNC5C甲基化情况，分析UNC5C甲基化与大肠癌发病的相关性。结果广泛UNC5C甲基化(区域1和区域2均甲基化)及部分甲基化(区域1或区域2甲基化)在大肠癌组织、腺瘤组织及正常黏膜组织中分别占59%(32/54)和87%(47/54)，8%(4/52)和38%(20/52)，0%(0/54)和9%(5/54)。无论广泛还是部分UNC5C的甲基化率大肠癌组织均明显高于腺瘤组织及正常组织(P均<0.05)。UNC5C基因在Ⅰ～Ⅱ期以及Ⅲ～Ⅳ期的甲基化水平均显著高于未甲基化水平，Ⅰ～Ⅱ期甲基化水平与Ⅲ～Ⅳ期甲基化水平相比差异无统计学意义(P均>0.05)。UNC5C甲基化与大肠癌发病呈显著正相关(r=0.856，P<0.05)，但广泛甲基化与肿瘤的分期并无明显相关性。结论Netrin-1受体UNC5C甲基化及其范围与大肠癌发生具有紧密联系，值得临床重视。

Netrin-1受体；UNC5C甲基化；广泛甲基化；部分甲基化；大肠癌

大肠癌是一类高发性肿瘤，随着社会的不断发展和越来越多的化学试剂或物理射线等致癌因素的出现，其发病率也随之呈上升趋势[1]。大肠癌的发病机制复杂，是由多个基因在一系列反应过程中介导的组织细胞癌变。相关研究表明：神经突起生长导向因子(Nertin-1)在大肠组织癌变中有关键促进作用，而UNC5C作为Nertin-1的受体之一，亦与大肠癌变具显著相关性[2]。另有研究报道，UNC5C属一类抑癌性基因，其表达程度直接关系到大肠组织的癌变，而基因的表达受其启动因子甲基化的调控[3]。因此，本研究主要基于PCR扩增技术和统计学分析方法对UNC5C基因甲基化及其范围与大肠癌的相关性进行了分析，现将结果报道如下。

1 临床资料

1.1一般资料 收集2007年2月—2010年3月在开滦总医院行大肠癌和腺瘤手术的病患中部分切除组织标本，其中散发性大肠癌54例，男34例，女20例；年龄33～84(59.5±5.7)岁；结肠癌29例，直肠癌25例；TNM分期Ⅰ期12例；Dukes分期：A期6例；浸润程度：T17例，有淋巴结转移26例；Ⅱ期4例,Dukes分期：B期21例，浸润程度：T23例，Ⅲ期13例，C期25例，T335例，无淋巴结转移25例。Ⅳ期25例；D期2例；T49例。大肠腺瘤52例，男37例，女15例；年龄32～83(64.8±3.8)岁。全部标本均由病理学证实，病患在手术前无放、化疗及其他生物治疗等历史。

1.2标本采集 标本源于病患大肠癌组织(避免在肿瘤中心处的坏死区采集)及手术的切缘组织(取自标本的近切端相应切缘处)及腺瘤组织。标本在离体之后快速置于-196℃的液氮内冷冻，之后置于-85℃的冰箱内保存备用。而后另取部分组织放置在10%中性甲醛液内固定并以石蜡包埋。

1.3主要仪器 德国Analytik Jena AG公司的flexcycler PCR仪，美国Bio-Rad公司 PowerPacTM Basic Power Supply型电泳仪，美国Bio-Rad公司Sub-Cell GT电泳槽，加拿大carestream公司的Gel Logic 212PRO型凝胶成像的分析系统；美国Thermo公司Ultro freeze 3410超低温冰箱，中国宁波永新光学股份有限公司NIB-100型显微镜等。

1.4主要试剂 PCR扩增引物中各序列均由上海英骏公司设计合成；琼脂糖购于美国Promega公司；宝生物TEXPAT试剂盒；EZ DNA Methylation KitTM。

1.5研究方法石蜡标本DNA抽出使用宝生物TEXPAT试剂盒，严格按照试剂盒的说明书进行仔细操作。使用EZ DNA Methylation KitTM进行DNA的亚硫酸盐处理。经甲基化引物增扩后使用结合重亚硫酸盐限制性内切酶法(COBRA法)进行分析。

1.6甲基化引物 UNC5C 区域1：上游引物为GTYGGTT GGGGTAGTGTAAAAGTT，下游引物为AACCTACCRCCTAC CACCTTCTTC；区域2：上游引物为TTTAGTGGGGTTTTTAGT TGTTTG，下游引物为TATCCCAATCCCAATCCRCAAC。56℃ 5次，54℃ 10次，52℃ 30次，产物长度分别为175bp和125bp；酶切后产物长度分别为(Hhal 37℃，12h)175bp、146bp和125bp、100bp(Hhal)。

1.7统计学方法数据资料采用SPSS 13.0统计软件分析。计数资料比较采用2检验，计量资料比较采用t检验，相关性分析采用Spearman法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.13组组织标本中UNC5C广泛甲基化与部分甲基化情况比较 大肠癌组织组UNC5C广泛甲基化率为59%(32/54)，腺瘤组织为8%(4/52)，正常黏膜组织为0，大肠癌组织UNC5C广泛甲基化率显著高于腺瘤组织及正常黏膜组织(P均<0.05)；大肠癌组织中UNC5C部分甲基化率为87%(47/54)，腺瘤组织为38%(20/52)，正常黏膜组织为9%(5/54)，大肠癌组织中UNC5C部分甲基化率亦显著高于腺瘤组织及正常黏膜组织(P均<0.05)。

2.2UNC5C甲基化与肿瘤TNM分期情况比较 大肠癌组织中，Ⅰ+Ⅱ期患者UNC5C甲基化(包括广泛甲基化和部分甲基化)率为81%(13/16)，非甲基化率为19%(3/16)，甲基化率显著高于非甲基化率(t=0.543,P<0.05)；Ⅲ+Ⅳ期患者UNC5C甲基化率为82%(31/38)，非甲基化率为18%(7/38)，甲基化率显著高于非甲基化率(t=0.842,P<0.05)。Ⅰ+Ⅱ期与Ⅲ+Ⅳ期患者的甲基化率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3病理参数与UNC5C甲基化相关性分析 大肠组织癌变与UNC5C广泛甲基化和部分甲基化均具显著相关性(P均<0.05)，Dukes分期、浸润程度、淋巴结转移、年龄、性别、肿瘤位置、分化程度、TNM分期与UNC5甲基化、广泛甲基化及部分甲基化均无明显相关性，尤其与UNC5C广泛甲基化无明显相关性。见表1。

表1 大肠癌病理参数与UNC5C甲基化Spearman相关性分析

3 讨 论

Nertin-1主要通过激活受体或信号通道介导大肠组织癌变[5-6]。UNC5H基因作为 Nertin-1的受体之一，其足够的表达水平能够对大肠癌变产生抑制作用。UNC5C为UNC5H基因家族中的一种，与大肠恶性肿瘤的产生具有显著相关性[7]。Thiebault等[8]在对多种肿瘤的UNC5A～C表达水平研究中发现，各种肿瘤中UNC5A～C的表达水平均显著低于相应对照组(P均<0.05)。刘旭东[9]研究发现80%的大肠癌患者癌组织中UNC5C表达水平低于其切除边缘组织，得出UNC5C基因的表达水平对大肠癌疾病发展程度以及治疗效果的诊断具有积极意义。

本研究结果发现，UNC5C广泛甲基化率、部分甲基化率癌变组织中均显著高于腺癌组织及正常黏膜组织，表明无论是UNC5C广泛甲基化还是部分甲基化均与癌变组织呈显著正相关性。在UNC5C甲基化与肿瘤TNM分期的比较中，Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期甲基化水平均显著高于非甲基化水平，而Ⅰ+Ⅱ期甲基化率与Ⅲ+Ⅳ期甲基化率比较差异无统计学意义，表明UNC5C甲基化率与TNM分期无显著相关性。而Spearman相关性分析显示癌变组织与UNC5C甲基化、广泛甲基化、部分甲基化均具显著相关性，而癌变Dukes分期、浸润程度、淋巴结转移、年龄、性别、肿瘤位置、分化程度、TNM分期与UNC5C甲基化、广泛甲基化及部分甲基化均无显著相关性，尤其与UNC5C广泛甲基化无明显关联。

综上所述，UNC5C广泛甲基化及部分甲基化均与大肠癌变具显著相关性，提示Netrin-1受体UNC5C甲基化及其范围与大肠癌发病具有紧密联系，值得临床重视。

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[9] 刘旭东. 大肠癌中Nertin-1依赖性受体DCC、UNC5C表达与细胞凋亡的相关性研究[D]. 天津：天津医科大学，2006

Correlation analysis of Netrin-1receptor UNC5C wide methylation and colorectal cancer

SUN Dongsheng1, JIA Fengjie1, LIU Ning1, WANG Gang1, LI Haiyang1, GAO Chunyan1, WANG Zhigang2

(1.Kailuan General Hospital, Tangshan 063000, Hebei, China; 2.Life Sciences College of Inner Mongolia University, Hohhot 010021, Inner Mongolia, China)

Objective It is to approach the correlation of Netrin-1receptor UNC5C wide methylation and colorectal cancer in occurrence, development of colorectal cancer.Methods Methylation state of UNC5C in two regions of the promoter of UNC5C (zones 1and 2) in 54patients with sporadic colorectal cancer related normal mucosa, and 52cases of colorectal adenoma tissue by using combined bisulfite restriction endonuclease method (COBRA), than the correlation of UNC5C methylation and incidence of colorectal cancer.Results The rate of extensive methylation of UNC5C (region 1and region 2methylation) and partial methylation (zone 1or zone 2methylated) in Colorectal cancer, adenoma and normal mucosa tissues is 59% (32/54) and 87% (47/54), 8% (4/52) and 38% (20/52), 0% (0/54) and 9% (5/54) respectively.Whether widely or part methylation rate of UNC5C in colorectal cancer was significantly higher in adenoma and normal mucosa tissues (allP<0.05).The methylation levels of UNC5C gene in Ⅰ to Ⅱ stage and Ⅲ to Ⅳ stage were significantly higher than those of no methylation, there was no significant difference in methylation level between Ⅰ to Ⅱ stage and Ⅲ to Ⅳ stage (P>0.05).UNC5C methylation was positively correlated with the incidence of colorectal cance (r=0.856,P<0.05), but there was no correlation between extensive methylation and tumor stage.Conclusion Netrin-1receptor UNC5C methylation and its range is close contacted to the colorectal diseases, it is worthy of attention.

Netrin-1receptor; UNC5C methylation; extensive methylation; partial methylation; colorectal cancer disease

孙冬生，男，主治医师，从事抑癌基因甲基化与消化道肿瘤关系的研究。

中国煤炭工业协会2012年度科学技术研究指导性计划项目(MTKJ2012-420)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.18.009

R0735.34

A

1008-8849(2015)18-1964-03

2015-03-02