三参汤对早期糖尿病肾病大鼠血清血管紧张素Ⅱ、VEGF和尿ET-1含量的影响

陈贵海，陈 娟，唐爱华，夏 猛，蓝丽霞，连利军，何清平

(1.陕西中医学院，陕西 咸阳 712046；2.北京科园信海医药经营有限公司，北京 100071；3.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；4.广西中医药大学，广西 南宁 530001)

三参汤对早期糖尿病肾病大鼠血清血管紧张素Ⅱ、VEGF和尿ET-1含量的影响

陈贵海1，陈 娟2，唐爱华3，夏 猛4，蓝丽霞4，连利军4，何清平4

(1.陕西中医学院，陕西 咸阳 712046；2.北京科园信海医药经营有限公司，北京 100071；3.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；4.广西中医药大学，广西 南宁 530001)

目的观察三参汤对早期糖尿病肾病大鼠血清血管紧张素Ⅱ(ATⅡ)、血管内皮生长因子(VEGF)、血浆和尿内皮素-1(ET-1)的影响，探讨三参汤治疗早期糖尿病肾病的作用机制。方法采用高脂饲养+链脲佐菌素注射方法复制2型糖尿病肾病大鼠模型，造模成功大鼠随机分为模型组、对照组和治疗组各10只，另选10只尾静脉注射等量生理盐水大鼠作为空白组。模型组和空白组灌胃等体积生理盐水，对照组灌胃厄贝沙坦，治疗组灌胃三参汤，灌胃3周。治疗前后酶免法检测4组大鼠血清ATⅡ、VEGF、血浆和尿ET-1浓度，化学法检测尿微量白蛋白、血糖浓度。结果治疗后治疗组大鼠血清ATⅡ、VEGF和尿中ET-1浓度及血糖、尿微量白蛋白水平均明显低于模型组(P均<0.05)。结论三参汤可能通过调节肾素-血管紧张素系统而发挥治疗糖尿病肾病作用。

糖尿病肾病；三参汤；血管紧张素-Ⅱ；内皮素-1;血管内皮生长因子

糖尿病肾病(DN)是糖尿病慢性微血管病变并发症，住院2型糖尿病病程20～25年的患者DN发病率为20%～35%，25年以上者为57%[1-3]。随着糖尿病发病率的上升和病程延长，糖尿病发病率呈加速上升的趋势。糖尿病病变过程中一旦出现持续性显性蛋白尿，则肾功能持续性减退。糖尿病肾病已成为终末期肾功能衰竭的首要原因[4]。而微量蛋白尿期持续时间长、病理过程可逆，是防止发展为终末期肾病的时间窗口。西医治疗糖尿病肾病以控制血压和血糖为主，其中血管紧张素转换酶抑制剂为首选控制血压药物。三参汤对于降糖西药控制欠佳的2型糖尿病患者仍具有一定的降低血糖作用，治疗早期糖尿病肾病也有较好疗效。本研究采用高脂饮食+链脲佐菌素(STZ)诱导大鼠糖尿病肾病模型，进而从肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system,RAS)、血管内皮功能等方面探讨三参汤治疗早期糖尿病肾病的作用机制。

1 实验资料

1.1实验材料

1.1.1动物 雄性8周龄SPF级SD大鼠50只,体质量200～250g，由广西医科大学实验动物中心提供,动物批号：0001628, 许可证号：SCXK桂2003-0102。

1.1.2试药 STZ由美国Sigma公司生产，南宁天地扬生物科技有限公司提供,用前溶于新配置、冰浴的0.1mmol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液(pH=4.2)。三参汤由三七、西洋参、丹参、黄芪、川芎、生地、白芍药、水蛭、大黄、甘草按3∶3∶4∶4∶3∶3∶2∶1∶2∶1的比例组成，购于南宁市湘君大药房,水煎浓缩成含生药120%悬浊液，低温保存。厄贝沙坦片(安博维)为杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司生产，规格150mg/片，用前配制成混悬液。

1.1.3试剂 VEGF、血ATⅡ、ET-1酶免试剂盒由上海百沃生物科技有限公司生产、南宁天地扬生物技术有限公司提供。血糖、微量白蛋白试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.1.4主要仪器 Multiscan MK3全自动酶标仪，德国Thermo公司生产；5810R超低温离心机，Eppendorf；-80℃超低温冰箱，青岛海尔集团公司。

1.2方法

1.2.1动物造模 按照文献[5]报道的方法，大鼠预饲养3d后，给予高脂饲料(配方：猪油10%、蔗糖20%、蛋黄2.5%、基础饲料67.5%)饲养。随机取40只，一次性尾静脉注射STZ 55mg/kg，10min内注射完毕，注射STZ后给予蔗糖水15g/L 48h以减少早期死亡。另外10只尾静脉注射等量生理盐水，给予普通饲料，作为空白组。造模大鼠1周后尾静脉取血检测空腹血糖，≥15mmol/L的大鼠继续进入研究，每只大鼠测血糖后皮下注射长效胰岛素2～4IU/d,以防止发生酮尿,连续2周。给予STZ后第21天用代谢笼准确收集大鼠24h尿量检测尿微量白蛋白，≥65mg/L的大鼠可确认糖尿病肾病造模成功，排除造模不成功大鼠。

1.2.2分组与给药 造模成功大鼠30只，随机分为模型组、对照组和治疗组，与空白组共4组，每组10只。于分组次日(给予STZ之日起第22天)给予药物治疗，药物干预以6倍成人剂量灌胃给药(成人体质量以60kg计算)。治疗组给予三参汤7mL/(kg·d)，对照组给予厄贝沙坦50mg/(kg·d)，均稀释成3mL、水浴加热至室温灌胃，模型组及空白组给予等体积生理盐水，1次/d，连续3周。

1.3标本收集和检测方法于治疗前将大鼠置于代谢笼中，收集24h尿液,然后禁食(自由饮水)12h，尾静脉取血测空腹血糖。治疗完成时，同样方法收集尿液。然后腹腔注射10%水合氯醛0.3mL/100g体质量，麻醉后打开腹腔，腹主动脉取血6mL，分别放入预先加入EDTA的EP管中2mL和空EP管中4mL，制备血浆、血清。取血后立即摘取左侧肾脏，称质量后于冰上去掉包膜，纵向剖开，分别放入2个EP管中，液氮速冻后储存于-70℃冰箱备用。酶免法测血清VEGF、ATⅡ和血浆、尿液ET-1浓度，化学比浊法测血糖、尿微量白蛋白水平。

1.4统计学方法采用SPSS 10.0统计软件分析数据。治疗前后大鼠血糖、尿微量白蛋白浓度的比较采用自身配对的t检验；治疗后不同组间血清(或血浆)、尿ET-1及ATⅡ、VEGF浓度的比较采用单因素方差分析及两两比较(q检验)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组血糖、尿微量白蛋白含量比较 药物干预3周后，对照组和治疗组空腹血糖及尿微量白蛋白水平均明显下降，与模型组比较差异有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 治疗前后各组空腹血糖与尿微量白蛋白水平比较

注：①与治疗前比较，P<0.05;②与模型组比较,P<0.05。

2.2各组血浆和尿液ET-1含量比较 治疗后对照组和治疗组尿液ET-1浓度与模型组比较均明显降低(P均<0.01)。而模型组、对照组血浆ET-1浓度与治疗组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组血浆和尿液ET-1浓度比较

注：①与模型组比较,P<0.01。

2.3各组血清ATⅡ和VEGF含量比较 治疗后对照组和治疗组血清ATⅡ、VEGF浓度均明显低于模型组(P均<0.05),对照组和治疗组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

3 讨 论

糖尿病肾病属于中医学“消渴”“水肿”“尿浊”的范围，发病与体质因素、贪食肥甘、劳倦内伤等有关。消渴之初，为肺燥胃热之上中二消，迁延不愈，累及脾肾等脏，阴阳、气血亏虚，水湿、痰浊阻滞，脾肾统藏失司，后期多发展为肾虚血瘀[6]，出现蛋白尿，演变为糖尿病肾病。所以，瘀血是糖尿病肾病发生的重要病理因素，阴阳气血虚弱则伴随疾病发生发展的整个过程[7-8]。

表3 各组血清ATⅡ和VEGF含量比较

注：①与模型组比较,P<0.05。

三参汤系在过去“益气养阴活血方对2型糖尿病炎症因子影响的临床和实验研究”等基础上逐步固定下来的方剂[9-10]，可明显降低糖尿病肾病患者尿微量白蛋白含量和一氧化氮水平，改善全血黏度(低切及高切)、红细胞聚集指数等血液流变学指标。该方以广西特产三七(别名三七参、参三七、人参三七)活血化瘀，西洋参补肾益气、生津止渴为主药，配伍黄芪益气以行血、丹参活血养血为辅药，生地、川芎、水蛭助三七活血化瘀，生地、白芍既滋阴养血又可防止温燥药物耗血动血共为佐，甘草调和诸药为使。十药相合，活而不燥，补而不腻，共奏补肾益气、养阴活血之功。

现代医学认为高血糖状态可激活肾素-血管紧张素系统，使血管紧张素原黑心变为ATⅡ，ATⅡ对出球肾动脉有强烈的收缩作用，使肾小球内压升高，促进蛋白尿的形成。AT Ⅱ的释放会刺激ET-1的形成，进一步加强动脉收缩。而且高血糖以及肾小球毛细血管内压增高也可直接刺激ET-1的合成和释放增加。ET-1的强大缩血管作用和促平滑肌作用，可促进炎症和细胞增殖，促进细胞外基质的产生并导致血管纤维化。尿ET-1排泄量与尿β2球蛋白的排泄量呈正相关，且与肾损害程度呈正相关。当糖尿病肾病肾脏脏层细胞受损时，机体会大量释放VEGF，促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性，导致尿蛋白的排泄率增加。本研究结果显示，三参汤能够降低糖尿病肾病大鼠血清ATⅡ、VEGF和尿中ET-1含量，降低尿微量白蛋白含量，减缓肾小球硬化，控制病情发展，其可能机制是通过抑制ATⅡ的产生，进而降低ET-1、VEGF的表达和释放而发挥治疗作用。本研究未发现三参汤对血浆ET-1水平有显著影响，可能与离散度较大且样本数小有关，有待进一步研究。

[1] 向红丁.糖尿病肾脏病变[J].国外医学内分泌学分册，2004，24(2)：125-127；136

[2] 中华医学会糖尿病学分会慢性并发症调查组.1991—2000年全国住院糖尿病患者慢性并发症及相关大血管病变回顾性分析[J].中国医学科学院学报2002，24(5)：447-451

[3] 中华医学会糖尿病学分会糖尿病慢性并发症调查组.全国住院糖尿病患者慢性并发症及其相关危险因素10年回顾性调查分析[J].中国糖尿病杂志，2003，11(4)：232-237

[4] 谢鹏.糖尿病肾病治疗的新认识[J].国际移植与血液净化杂志，2007，5(1):4-5

[5] 康尖锋，吴纯，范丽,等.安博维对高血糖伴肾功能不全大鼠的保护作用[J].武警医学院学报，2011，20(6)：445-448

[6] 郭永红，李晓翠，张宏，等.吕仁和分期辨证论治慢性肾脏病常用16法[J].北京中医药，2010，29(9)：671-672

[7] 王保明，卢绍霞，景静.糖尿病肾病的中医药治疗[J].光明中医，2010，25(8)：36-37

[8] 葛冬梅.糖尿病肾病中医治疗[J].中国健康月刊：学术版, 2010,29(9)：94

[9] 范冠杰，唐咸玉，唐爱华，等.益气养阴活血化瘀法治疗早期糖尿病肾病的临床研究[J].新中医,2002，34(9)：39-40

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Influence of Sanshen Decoction on the levels of angio tensin Ⅱ, Endothelin-1, Vascular endothelial growth factor in rats with early diabetic nephropathy

CHEN Guihai1, CHEN Juan2, TANG Aihua3, XIA Meng4, LAN Lixia4, LIAN Lijun4, HE Qingping4

(1.Shanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, Sanxi, China; 2.Beijing Technology Garden XinHai Medicine Company, Beijing 100071, China; 3.The First Affiliated Hospital of Guangxi Institute of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi, China; 4.Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001, Guangxi, China)

Objective It is to observe the influence of Sanshen Decoction on angio tensin Ⅱ (ATⅡ), Endothelin-1(ET-1), Vascular endothelial growth factor (VEGF) levels of rats with early diabetic nephropathy, and investigate the mechanism in treatment of early diabetic nephropathy.Methods The rat models of type 2diabetic nephropathy were duplicated by using high-fat diet and streptozotocin and divided into model group, control group and treatment group with 10cases in each.Other 10rats by tail vein injected with saline were selected as the blank group.The animals were treated by intragastric administration for equal volume of saline in model group and blank group, irbesartan in control group and Sanshen Decoction in treatment group, the treatment kept for 3weeks.Before and after treatment, the levels of ATⅡ, ET-1, and VEGF were detected by ELISA method, and the levels of urine micro albumin and blood sugar were detected by chemical turbidimetry.Results After the treatment of Sanshen Decoction, the levels of ATⅡ, ET-1and VEGF were decreased, and the level of blood sugar and urine micro albumin were reduced, there were significant differences between treatment group and model group (allP<0.05).Conclusion Sanshen Decoction might play the therapeutic role on diabetic nephropathy through regulating the renin-angiotensin system.

diabetic nephropathy; Sanshen Decoction; angio tensin Ⅱ; Endothelin-1; vascular endothelial growth factor

陈贵海，男，医学博士，教授，硕士生导师，研究方向为藏象理论及应用基础研究。

何清平，E-mail：cjyz@gxtcmu.edu.cn

广西中医学院重点课题(ZD2009002);广西研究生教育创新计划项目(2010106001005M03)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.18.002

R-332

A

1008-8849(2015)18-1942-03

2014-09-15