张海峰
(冀中能源峰峰集团有限公司总医院,河北 邯郸 056200)
番茄红素对实验性糖尿病大鼠肾脏保护作用的研究
张海峰
(冀中能源峰峰集团有限公司总医院,河北 邯郸 056200)
[摘要]目的 研究番茄红素(Lycopene,LP)对实验性糖尿病大鼠肾脏的保护作用。方法 首先通过高脂高糖饮食饲养8周后腹腔注射链脲佐菌素(STZ)方法制备糖尿病大鼠模型,将造模成功的80只大鼠随机分为模型组、番茄红素5 mg/kg组、番茄红素10 mg/kg组、番茄红素20 mg/kg组和盐酸二甲双胍组,每组16只。另取16只健康大鼠作为正常对照组。正常对照组和模型组连续灌胃生理盐水,番茄红素各组和盐酸二甲双胍组分别连续灌胃相应剂量番茄红素和盐酸二甲双胍(200 mg/kg),每天1次,连续28 d。分别于给药前和给药后第7,14,28天测定各组大鼠胰岛素和空腹血糖水平。给药28 d后,观察各组大鼠一般状况,测定各组大鼠体质量、肾脏指数、24 h尿量、24 h尿蛋白量(UPro)及血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、尿酸(UA)水平;测定各组大鼠肾脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量;通过PAS染色观察肾脏组织病理形态学变化;通过TUNEL染色观察肾小球细胞凋亡状况,并计算凋亡指数(AI)。结果 番茄红素各组大鼠一般状况得到明显改善,其中以20 mg/kg组效果最为显著。番茄红素10 mg/kg组灌胃第28天胰岛素水平明显高于模型组,番茄红素20 mg/kg组灌胃第14,21,28天胰岛素水平均明显高于模型组。番茄红素20 mg/kg组灌胃第21,28天空腹血糖水平均显著低于模型组。番茄红素10 mg/kg组和番茄红素20 mg/kg组大鼠体质量显著高于模型组,肾脏指数、尿量、UPro及血清BUN、SCr、UA水平均显著低于模型组;肾脏组织中SOD活性显著高于模型组,MDA含量显著低于模型组,其中番茄红素20 mg/kg组GSH-Px活性显著高于模型组。番茄红素各组大鼠肾脏组织病理形态学改变和肾脏组织细胞凋亡状况均明显改善,其中以20 mg/kg组效果最为显著;并且番茄红素10 mg/kg组和番茄红素20 mg/kg组大鼠肾小球细胞凋亡指数显著低于模型组。结论 番茄红素对实验性糖尿病大鼠肾脏组织具有保护作用。
番茄红素;糖尿病;大鼠;肾脏保护
长期血糖控制不佳的糖尿病患者常伴有多个组织器官的并发症,其中肾脏损伤是糖尿病患者致残、甚至致死的主要原因。因此,在有效维持血糖水平的同时,还应积极控制糖尿病并发症的发生[1-2]。番茄红素(Lycopene,LP)是一种广泛存在于番茄、胡萝卜、西瓜等红色蔬菜水果中的类胡萝卜素,具有良好的抗氧化、抗肿瘤、增强机体免疫力等药理学作用[3-5]。本实验采用高脂高糖饲料喂养8周加腹腔注射STZ破坏胰岛细胞的方法制备的糖尿病大鼠模型,研究了番茄红素对糖尿病大鼠肾脏组织的保护作用。现报道如下。
1.1试验药物与试剂 番茄红素(南京泽朗生物科技有限公司,纯度≥96%,批号:ZL201401082a);盐酸二甲双胍购自河北天成药业股份有限公司(批号:20140721);24 h尿蛋白量(UPro)、血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、尿酸(UA)测定试剂盒购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司;总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;胰岛素酶联免疫(ELISA)检测试剂盒购自美国密理博公司;PAS、TUNEL染色试剂盒购自北京博奥森公司;STZ购自美国Sigma公司;乌拉坦购自北京化学试剂公司。
1.2 动物 SPF级雄性SD大鼠,体质量180~220 g,由河北省实验动物中心提供,许可证号:SCXK(冀)2008-1-003;饲养环境:室温22~25 ℃,相对湿度65%~70%,光照周期12 h∶12 h。
1.3 仪器 血糖仪(罗氏);BS-300型全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司);UV-1800型紫外分光光度计(日本岛津公司);CUT4062型石蜡切片机(德国SLEE公司);光学显微镜(日本Olympus公司);24D台式高速离心机(深圳市赛泰克生物科技有限公司);BL200S电子天平(美国SETRA公司)。
1.4 方法
1.4.1 模型的制备与分组 实验用大鼠经高脂高糖饮食8周后,经连续2 d腹腔注射STZ[30 mg/(kg·d)]破坏胰岛细胞制备糖尿病大鼠模型,分别于72 h和3 d后通过血糖仪测定空腹血糖水平,持续高于16.7 mmol/L即认定为造模成功;选取造模成功的80只大鼠,随机分为模型组、番茄红素5 mg/kg组、番茄红素10 mg/kg组、番茄红素20 mg/kg组和盐酸二甲双胍组,每组16只。另取16只健康大鼠作为正常对照组。正常对照组和模型组连续灌胃生理盐水,番茄红素各组和盐酸二甲双胍组分别连续灌胃相应剂量番茄红素和盐酸二甲双胍(200 mg/kg),每天1次,连续28 d。
1.4.2 各组大鼠一般状况的观察 灌胃28 d后,观察大鼠精神状态、外观、饮食、体质量情况。
1.4.3 胰岛素和空腹血糖水平测定 分别于灌胃前和灌胃后第7,14,21,28天由尾静脉取血,按照胰岛素ELISA试剂盒操作方法步骤平行测定各组大鼠胰岛素水平,并通过血糖仪平行测定各组大鼠空腹血糖水平并记录。
1.4.4 体质量及肾脏指数测定 灌胃28 d后,分别称量各组大鼠体质量;腹腔注射乌拉坦实施麻醉,开腹取肾脏组织,用生理盐水冲洗并用滤纸吸干后,称量左侧肾脏质量,计算肾脏指数:肾脏指数=左侧肾脏质量/体质量。
1.4.5 尿量及UPro测定 干预28 d后,测定各组大鼠24 h尿量,并通过磺基水杨酸法测定分析测定各组大鼠UPro值。
1.4.6 血清BUN、SCr、UA水平测定 灌胃28 d后,腹腔注射乌拉坦实施麻醉,开腹经腹主动脉取血,1 500 r/min离心10 min后取血清,严格按照测定试剂盒说明书操作方法,通过生化分析仪平行测定各组大鼠血清BUN、SCr、UA水平。
1.4.7 肾脏组织中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的测定经1.4.4所取右侧肾脏组织,剪碎后加入适量冷裂解液进行研磨匀浆,3 000 r/min离心10 min后取上层液,按照试剂盒操作方法,通过紫外-可见分光度计测定各组大鼠肾脏组织中SOD、GSH-Px活性和MDA含量。
1.4.8 肾脏组织病理形态学观察 经1.4.4称量后的左侧肾脏组织置于4%的多聚甲醛溶液中进行固定,经石蜡包埋、切片(厚度为5 μm)处理后,进行PAS染色,通过光学显微镜观察肾脏组织病理形态学改变并照相。
1.4.9 肾小球细胞凋亡状况观察及凋亡指数(AI)计算 取1.4.8制备的石蜡切片,按照试剂盒操作方法步骤行TUNEL染色,然后通过光学显微镜观察各组大鼠肾小球细胞凋亡状况。每张切片随机选取5个视野,计数每个视野中肾小球细胞总数以及阳性凋亡细胞数(细胞核黄染为阳性着色,即凋亡细胞),然后计算凋亡指数(AI):AI=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。
2.1各组大鼠一般状况 正常对照组大鼠精神状态良好,饮食、饮水及大小便正常,皮毛有光泽,体质量逐渐增加;模型组大鼠精神萎靡,出现明显的“三多一少”症状,体质量逐渐减轻,体毛枯黄、稀疏;番茄红素各组大鼠精神状态好转,“三多一少”症状减轻,体毛光洁,其中番茄红素20mg/kg组效果最为显著。
2.2 各组大鼠胰岛素水平比较 灌胃后不同时间模型组大鼠胰岛素水平均显著低于正常对照组(P均<0.01),番茄红素10mg/kg组灌胃第28天胰岛素水平明显高于模型组(P<0.05),番茄红素20mg/kg组灌胃第14,21,28天胰岛素水平均明显高于模型组(P<0.05和P<0.01)。见表1。
表1 各组大鼠灌胃前及灌胃后不同时间胰岛素水平比较
注:①与正常对照组比较,P<0.01;②与模型组比较,P<0.05;③与模型组比较,P<0.01。
2.3 各组大鼠空腹血糖水平比较 灌胃后不同时间模型组大鼠空腹血糖水平均显著高于正常对照组(P均<0.01);番茄红素20mg/kg组灌胃第21,28天空腹血糖水平均显著低于模型组(P<0.05和P<0.01),盐酸二甲双胍组灌胃第14,21,28天空腹血糖水平均显著低于模型组(P<0.01)。见表2。
表2 各组大鼠灌胃前及灌胃后不同时间空腹血糖水平比较
注:①与正常对照组比较,P<0.01;②与模型组比较,P<0.05;③与模型组比较,P<0.01;④与番茄红素10mg/kg组比较,P<0.05。
2.4 各组大鼠体质量、肾脏指数、尿量和UPro比较 灌胃28d后,与正常对照组比较,模型组大鼠体质量显著减轻,肾脏指数、尿量和UPro显著升高,差异均具有统计学意义(P均<0.01);番茄红素10mg/kg组和番茄红素20mg/kg组大鼠体质量显著高于模型组(P<0.05和P<0.01),肾脏指数、尿量和UPro均显著低于模型组(P<0.05和P<0.01)。见表3。
表3 各组大鼠体质量、肾脏指数、尿量和UPro比较
注:①与正常对照组比较,P<0.01;②与模型组比较,P<0.05;③与模型组比较,P<0.01;④与番茄红素10mg/kg组比较,P<0.05。
2.5 各组大鼠血清BUN、SCr、UA水平比较 灌胃28d后,与正常对照组比较,模型组大鼠BUN、SCr、UA水平均显著升高(P均<0.01);番茄红素10mg/kg组和番茄红素20mg/kg组血清BUN、SCr、UA水平均显著低于模型组(P<0.05和P<0.01),番茄红素20mg/kg组血清BUN水平明显低于番茄红素10mg/kg组(P<0.01)。见表4。
2.6 各组大鼠肾脏组织中SOD、GSH-Px活性和MDA含量比较 与正常对照组比较,模型组大鼠肾脏组织中SOD、GSH-Px活性显著降低而MDA含量显著升高(P均<0.01);与模型组比较,番茄红素10mg/kg组和番茄红素20mg/kg组大鼠肾脏组织中SOD活性显著升高而MDA含量显著降低(P<0.05和P<0.01),番茄红素20mg/kg组GSH-Px活性显著升高(P<0.05)。见表5。
2.7 各组大鼠肾脏组织病理形态学变化 经过PAS染色后观察发现,正常对照组大鼠肾脏组织肾小球结构完整,体积未见增大,见图1;模型组大鼠肾小球体积增大、系膜增生,肾小管上皮细胞呈空泡变性,间质区可见淋巴细胞浸润,见图2;番茄红素各组大鼠肾脏组织病变出现不同程度的改善,其中以20mg/kg组效果最为显著,见图3~5;盐酸二甲双胍组大鼠肾脏组织病变较模型对照组明显改善,其效果与番茄红素20mg/kg组无明显差异。
表4 各组大鼠血清BUN、SCr、UA水平比较
注:①与正常对照组比较,P<0.01;②与模型组比较,P<0.05;③与模型组比较,P<0.01;④与番茄红素10mg/kg组比较,P<0.05;⑤与番茄红素10mg/kg组比较,P<0.01。
表5 各组大鼠肾脏组织中SOD、GSH-Px活性和MDA含量比较
注:①与正常对照组比较,P<0.01;②与模型组比较,P<0.05;③与模型组比较,P<0.01;④与番茄红素10mg/kg组比较,P<0.05。
图1 正常对照组大鼠肾脏组织病理学表现(PAS×400)
图2 模型组大鼠肾脏组织病理学表现(PAS×400)
图3 番茄红素5 mg/kg组大鼠肾脏组织病理学表现(PAS×400)
图4 番茄红素10 mg/kg组大鼠肾脏组织病理学表现(PAS×400)
图5 番茄红素20 mg/kg组大鼠肾脏组织病理学表现(PAS×400)
2.8 各组大鼠肾小球细胞凋亡状况及凋亡指数 经TUNEL染色后观察发现,正常对照组大鼠肾脏组织存在极少量凋亡细胞,见图6;模型组大鼠肾小球细胞凋亡状况明显加重,见图7;番茄红素各组大鼠肾小球凋亡细胞数量明显减少,其中以20mg/kg组最为显著,见图8~10;盐酸二甲双胍组大鼠肾小球消亡细胞数明显减少,但效果不及番茄红素20mg/kg组显著,见图11。模型组、番茄红素5mg/kg组、番茄红素10mg/kg组、番茄红素20mg/kg组和盐酸二甲双胍组凋亡指数分别为(3.7±1.2)%、(52.4±10.6)%、(46.1±12.0)%、(30.5±7.4)%、(16.3±5.2)%、(37.8±9.1)%,模型组凋亡指数明显高于正常对照组(P<0.01),番茄红素10mg/kg组、番茄红素20mg/kg组凋亡指数显著低于模型组(P<0.05和P<0.01)。
近年来,随着人们生活水平的提高以及饮食结构的改变,糖尿病的发病率逐年上升,严重危害着人类的生命健康和生活质量。随着病理生理学研究的不断深入,发现糖脂代谢异常而导致的氧自由基过剩进而所引发的广泛氧化应激损伤是糖尿病损伤及其并发症发生发展的共同通路之一[6]。
图6 正常对照组大鼠肾小球细胞凋亡状况(PAS×400)
图7 模型组大鼠肾小球细胞凋亡状况(PAS×400)
图8 番茄红素5 mg/kg组大鼠肾小球细胞凋亡状况(PAS×400)
图9 番茄红素10 mg/kg组大鼠肾小球细胞凋亡状况(PAS×400)
图10 番茄红素20 mg/kg组大鼠肾小球细胞凋亡状况(PAS×400)
图11 盐酸二甲双胍组大鼠肾小球细胞凋亡状况(PAS×400)
番茄红素是广泛存在于红色蔬菜和水果中的一种类胡萝卜素,具有良好的抗氧化、抗肿瘤等生物活性。本实验结果发现,经番茄红素灌胃28d后,糖尿病大鼠胰岛素水平显著升高,空腹血糖水平显著降低;体质量显著升高,肾脏指数、尿量、UPro及血清BUN、SCr、UA水平均显著降低,其中以番茄红素20mg/kg组效果最为显著,提示番茄红素高剂量可改善糖尿病大鼠肾功能及肾脏组织病理学改变,抑制肾小球细胞凋亡。
氧自由基能够在SOD和GSH-Px催化作用下还原生成对人体无害的H2O和O2[7];MDA为脂质过氧化终产物,因此肾脏组织中MDA的含量能够间接反映肾脏组织氧化应激损伤程度。本研究发现,番茄红素能够有效提高糖尿病大鼠肾组织中抗氧化酶(SOD、GSH-Px)活性,降低MDA含量,并且高剂量效果好,提示番茄红素能够有效抑制糖尿病大鼠肾脏组织氧化应激损伤。
综上所述,番茄红素对实验性糖尿病大鼠肾脏组织具有保护作用。
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Protective effects of Lycopene on the kidneys in experimental diabetic rats
ZHANG Haifeng
(Jizhong Energy Fengfeng Group Hospital, Handan 056200, Hebei, China)
Objective It is to investigate the protective effects of Lycopene (LP) on the kidneys in experimental diabetic rats. Methods 80 diabetic rat models made by intraperitoneal injecting STZ after feeding with high fat and sugar diet for 8 weeks were randomly divided into 5 groups: model group, LP 5, 10, 20 mg/kg groups and Metformin hydrochloride group, each group had 16 rats. Another 16 same-aged rats were selected as normal control group. Normal control group and model group were given normal saline by intragastric administration, every LP group and Metformin hydrochloride group were treated with respective dosage of LP or Metformin hydrochloride (200 mg/kg) once a day and for 28 days. Before and once week after the drug was given, the levels of insulin and blood sugar were determined. Four weeks later, the general status of the rats were observed; the body weight, renal index(RI), 24 h urine volume, UPro and the content of BUN, SCr, UA in serum were determined; the activity of SOD, GSH-Px and the content of MDA in renal tissue were determined; the renal tissue histo-pathological changes was observed by HE staining; the apoptosis of renal cells was observed by TUNEL staining, and the apoptosis index(AI) was alculated. Results Compared with diabetic model group, the general status of the rats in LP treated groups were improved, especially in 20 mg/kg group the improvements were more significant; the level of insulin in LP 10 mg/kg group was significantly higher than that in model group on the 28th day, while the levels in 20 mg/kg group on the 14th, 21th, 28th day were all higher than that in model group. The blood sugar level of LP 20 mg/kg group was significantly lower than that in model group on the 21th and 28th days; the body weight and SOD activity in LP 10, 20 mg/kg groups were significantly higher, while RI, urine volume, UPro and the levels of serum BUN, SCr, UA, MDA were lower than that in model group. The activity of GSH-Px of LP 20 mg/kg group was significantly higher than that in model group. The histopathological changes and the apoptosis of the renal tissue in LP treated groups were significantly improved, especially in LP 20 mg/kg group the improvements were more significant, and AI of LP 10, 20 mg/kg groups were significantly lower than than in model group. Conclusion LP had dose-dependent protective effects on kidneys in experiment diabetic rats.
Lycopene; diabetes; rat; kidney protection
张海峰,男,主管药师,从事临床药学研究工作。
10.3969/j.issn.1008-8849.2015.25.009
R-332
A
1008-8849(2015)25-2762-05
2015-04-09