白细胞介素-6-572位点单核苷酸多态性与痰瘀阻肺型、肺肾气虚型肺胀相关性分析

杨文昊，舒慧敏，刘凤阁

(1. 湖北医药学院附属人民医院，湖北 十堰 442000；2. 湖北省丹江口市第一医院，湖北 丹江口 442700)

白细胞介素-6-572位点单核苷酸多态性与痰瘀阻肺型、肺肾气虚型肺胀相关性分析

杨文昊1，舒慧敏2，刘凤阁1

(1. 湖北医药学院附属人民医院，湖北 十堰 442000；2. 湖北省丹江口市第一医院，湖北 丹江口 442700)

[摘要]目的 探讨白细胞介素-6(IL-6)-572位点单核苷酸多态性与痰瘀阻肺型、肺肾气虚型肺胀相关性。方法 选取十堰地区汉族肺肾气虚型肺胀患者78例作为肺肾气虚型组，痰瘀阻肺型肺胀患者64例作为痰瘀阻肺型组，另选择同地区汉族健康受试者182例作为对照组。应用聚合酶链反应、酶切技术对3组IL-6-572位点单核苷酸多态性进行研究，应用夹心酶联免疫吸附法测定血清IL-6水平。结果 3组间CC、CG、GG基因型分布情况比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。肺肾气虚型组和痰瘀阻肺型组血清IL-6水平均高于对照组(P均<0.05)，肺肾气虚型组和痰瘀阻肺型组比较差异无统计学意义。结论 IL-6-572位点单核苷酸多态性与痰瘀阻肺型、肺肾气虚型肺胀的发病无明显相关性。

慢性阻塞性肺疾病；白细胞介素-6；单核苷酸多态性；痰瘀阻肺型；肺肾气虚型；肺胀

肺胀是多种慢性肺系疾患反复发作，迁延不愈，导致肺气胀满、不能敛降的一种病证，其临床证候特点与西医学中慢性阻塞性肺疾病(COPD)相类似，痰瘀阻肺型与肺肾气虚型为肺胀患者常见辨证分型。白细胞介素-6(IL-6)基因启动子单核甘酸多态性(single nucleotide polymorphisms， SNPs)是近年来研究较多的一个热点，本研究探讨了肺胀患者IL-6-572位点单核苷酸多态性与中医辨证分型易感性的关系，旨在为肺胀的诊治提供更多依据。

1 临床资料

1.1一般资料 选择2012年3月—2013年10月在湖北医药学院附属人民医院就诊的十堰地区汉族肺胀患者142例，均为在十堰地区出生并长期居住者，均符合中华医学会呼吸病学分会《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》(2007年修订版)的诊断标准, 并且每名患者均由2名经统一培训的主治以上职称的中医医师，按照中华中医药学会2008年制定的《中医内科常见病诊疗指南—中医病证部分》和2010年全国中医内科肺系病第十四次学术研讨会通过“慢性阻塞性肺疾病中医诊疗指南”进行中医诊断和辨证。其中痰瘀阻肺型患者64例作为痰瘀阻肺型组，肺肾气虚型肺胀患者78例作为肺肾气虚型组。另选择同地区汉族健康体检者182例作为对照组。所用受试者相互之间均无血缘关系，经询问病史、体格检查、胸部X射线胸片或胸部CT及心电图、血糖等检查后，排除肺间质纤维化、哮喘等慢性肺部疾病者。本研究经本院伦理委员会审核通过，受试者均对本研究知情同意并签字。

1.2 研究方法

1.2.1 资料收集 统计入选者性别、年龄、吸烟史及吸烟指数(吸烟指数=平均每天吸烟支数×吸烟年数)，采用Master Screen肺功能仪对患者进行肺功能检查。

1.2.2 基因型及血清IL-6水平检测 采集受检者肘静脉空腹血5 mL以备测试。使用E.ZNA Blood DNA Kit(美国OMEGA公司提供)，将基因组DNA溶于TE溶液中备用。采用聚合酶链反应(PCR)，以基因组DNA为模板进行DNA扩增。PCR反应体系为50 μL，其中模板DNA 1 μL，2×GC PCR缓冲液25 μL，LA Taq酶0.5 μL，0.5 mmol/L三磷酸脱氧核苷dNTP 8 μL，100 pmol/μL上、下游引物各1 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min后，92 ℃变形30 S，56 ℃退火30 S，72 ℃延伸30 S，32个循环后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。上游引物为5’-GGAGACGCCTTGAAGTAACTGC-3’，下游引物为5’-GAGTTTCCTCTGACTCCATCGCAG-3’。PCR扩增产物上样于1%琼脂糖凝胶，100 V恒压电泳40 min。将电泳后的凝胶放在紫外透视仪上观察电泳条带，若条带清晰，无其他杂带，说明PCR产物扩增成功。扩增产物的限制性酶：取扩增产物2 μL，缓冲液2 μL， MbiⅠ限制性内切酶2 μL，无菌去离子水14 μL，37 ℃水浴箱孵育3 h。酶切产物以聚丙烯酰胺凝胶-溴化乙锭进行鉴定，电泳结果应用自动凝胶成像及分析系统进行成像、分析。用夹心酶联免疫吸附法测定血清IL-6水平。

1.3 统计学方法 用SAS统计软件进行数据分析，计数资料使用卡方检验，计量资料使用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.13组临床资料比较 3组性别构成、年龄、吸烟史、吸烟指数的分布比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。痰瘀阻肺型组和肺肾气虚型组肺功能指标均明显低于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 3组临床资料比较

注：①与对照组比较，P<0.05。

2.2 IL-6-572位点单核苷酸多态性的基因图谱 根据限制性酶切片段大小判断IL-6-572位点的3种基因型。IL-6-572 CC、GG、CG3种基因型分别对应1条(163 bp)、2条(101 bp、62 bp)、3条(163 bp、101 bp、62 bp)。见图1。

1，3，4，5为CC基因型；2为GG基因型；6为CG基因型图1 IL-6-572位点的基因图谱

2.3 3组IL-6-572位点基因型构成比较 在IL-6-572位点上，3组间 CC、CG、GG基因型频率分布比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

2.4 3组血清IL-6水平比较 痰瘀阻肺型组、肺肾气虚型组、对照组血清IL-6水平分别为(6.04±0.19)pg/mL、(5.95±0.22)pg/mL、(3.86±0.72)pg/mL，痰瘀阻肺型组与肺肾气虚型组均高于对照组(P均<0.05)。

表2 3组IL-6-572位点基因型构成情况 频数

3 讨 论

吸烟是慢性阻塞性肺疾病的主要危险因素,与气道阻塞有明确的关系，但仅有15%的慢性重度吸烟者发展成为有症状的慢性阻塞性肺疾病患者，表明遗传因素在慢性阻塞性肺疾病的发病中起着重要的作用。近年来通过研究发现某些证候与某些基因有一定关联性，某些基因型可能是某些证候的易感因素。目前慢性阻塞性肺疾病中医发病研究多采用辨病与辨证相结合的模式，但若在肺胀病证结合基础上探讨中医证型与基因多态性的相关性，将更有利于中医辨证分型客观化，有利于进一步提高中医辨证论治水平和临床疗效。痰瘀阻肺及肺肾气虚是肺胀患者临床常见证型，不同分型患者有不同临床表现及治疗侧重点。

研究表明，IL-6具有促炎性细胞分化、趋化，并上调黏附分子和其他细胞因子的表达，增强炎症反应效应[1]。 IL-6过度表达与慢性阻塞性肺疾病患者的呼吸困难[2]、骨骼肌乏力[3]、胰岛素抵抗[4]、肺动脉高压[5]、病情恶化[6]相关；在鼠类模型中发现过度表达IL-6可诱发肺气肿和气道炎症[7]；即使在COPD稳定期，患者血CRP、纤维蛋白原、血小板和白细胞也比健康对照者偏高[8]，而IL-6能够上调他们的表达。IL-6在患者血清、呼出冷凝物、痰液中的高表达能预测FEV1快速下降，并同患者体质量下降及肌肉废用密切相关[9-10]；可以发现经吸入糖皮质激素有效治疗后IL-6浓度下降[11]。这些提示IL-6与慢性阻塞性肺疾病的发病机制密切相关。Cordoba-Lanus等[12]研究认为IL-6-597G/A和IL-6-174G/C位点多态性与西班牙人慢性阻塞性肺疾病发病无关，IL-6-572C/G位点的C等位基因可以降低西班牙人发展为慢性阻塞性肺疾病的风险。本研究结果显示，各组间 IL-6-572C/G 多态性比较差异无统计学意义，提示IL-6-572位点单核苷酸多态性可能与肺胀患者痰瘀阻肺型、肺肾气虚型发病无明显相关性。痰瘀阻肺型、肺肾气虚型血清IL-6水平高于对照组，考虑可能慢性阻塞性肺疾病为全身炎症反应性疾病，IL-6生成可能与其他炎症因子参与调控有关。但是还需要更大样本量的同类研究来提供进一步的证据。

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Analysis of correlation of IL-6 -572 single nueleotide polymorphism with lung distension of lung retention of phlegn and blood stasis type and lung-kidney Qi deficiency type

YANG Wenhao1, SHU Huimin2, LIU Fengge1

(1. The People’s Hospital of Hubei Medical College, Shiyan 442000, Hubei, China; 2. The First Hospital of Danjiangkou 442700, Hubei, China)

Objective It is to investigate the correlation of IL-6 -572 single nueleotide polymorphism (SNP) with lung distension of lung retention of phlegn and blood stasis type and lung-kidney Qi deficiency type． Methods 78 Han patients with lung distension of lung-kidney Qi deficiency type in Shiyan area were selected as lung-kidney Qi deficiency type group, 64 ones of lung retention of phlegn and blood stasis type as lung retention of phlegn and blood stasis type group, 182 healthy ones as control group. The SNP-572 in the IL-6 promoter gene were analyzed by using PCR-RFLP method，the concentrations of serum IL-6 were measured by using ELISA kit. Results There was no statistically differences in the distribution of genotype CC, CG, GG among the three groups (P>0.05). The levels of serum IL-6 in lung-kidney Qi deficiency type group and lung retention of phlegn and blood stasis type group were both higher than that in control group (P<0.05), but there was no significant difference in the level between lung-kidney Qi deficiency type group and lung retention of phlegn and blood stasis type group. Conclusion IL-6 572 SNP was not correlated with the pathogens of COPD patients of lung-kidney Qi deficiency type and lung retention of phlegn and blood stasis type.

chronic obstructive pulmonary disease; IL-6; single nueleotide polymorphism; lung-kidney Qi deficiency type; lung retention of phlegn and blood stasis type; lung distension

杨文昊，男，硕士研究生，主要从事中西医结合防治呼吸系统疾病研究。

刘凤阁，E-mail:syliufg@sina.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.25.007

R743.3

A

1008-8849(2015)25-2756-03

2015-03-10