神经肽Y对小神经胶质细胞活化状态和生成IL-1β的影响

李琦军邢兆国常军英吴永波张淑丽王颜志穆卫卢李炎贾东召

·论 著·

神经肽Y对小神经胶质细胞活化状态和生成IL-1β的影响

李琦军*邢兆国*常军英*吴永波△张淑丽※王颜志*穆卫卢*李炎*贾东召*

目的探讨神经肽Y(NPY)对原代小神经胶质细胞生物活性及生成IL-1β的影响。方法 培养的原代大鼠皮层小胶质细胞，将细胞分为Control组、LPS组、NPY+LPS组、NPY组和BIBP3226+NPY+LPS组，每组3个样本，培养各组细胞6h。经免疫细胞化学荧光染色后，显微镜下观察小胶质细胞的形态学变化。Eli⁃sa方法检测培养液中IL-1β蛋白含量，RT-PCR方法检测小胶质细胞中IL-1βmRNA表达水平。结果 孵育各组小胶质细胞 6h后，LPS组培养液中IL-1β蛋白的含量及细胞中IL-1βmRNA表达水平分别为（961.00± 83.50）pg/mL和5.59±0.87，显著高于Control组的96.33±24.58 pg/mL和1.05±0.12（P＜0.05），小胶质细胞处于活化状态；LPS+NPY组IL-1β蛋白含量和mRNA表达水平分别为(411.33±55.00)pg/mL和1.93±0.45，与LPS组相比显著降低（P＜0.05），小胶质细胞活化水平降低；IBP3226+NPY+LPS组IL-1β蛋白含量和mRNA表达水平分别为(886.00±97.53)pg/mL和4.51±0.71，与LPS+NPY组相比显著增高（P＜0.05）；LPS组和IBP3226+NPY+LPS组之间无统计学意义。NPY组与对照组无统计学意义。结论 NPY通过作用于NPY Y1受体降低小神经胶质细胞的生物活性，抑制其生成IL-1β。

神经肽-Y小神经胶质细胞 白介素-1β

小胶质细胞是一种广泛分布于中枢神经系统的巨噬细胞。正常状态下，小胶质细胞处于静息状态，在中枢神经系统中起着免疫监视作用。当内环境发生变化时会迅速被激活，激活后的小胶质细胞能够释放白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等细胞因子以及活性氧、活性氮、脂类等大量生物活性物质[1，2]，这些活性物质的过分释放并积聚于中枢神经系统会导致神经元损伤[3-5]。神经肽Y(NPY)是一种多肽类物质，广泛分布于中枢及周围神经系统，由36个氨基酸组成，与癫痫，学习和记忆都有着密切关系，NPY可以通过NPY Y2、Y5受体起到保护神经元作用。最近Ferreira R等研究[6]表明，NPY可以抑制脂多糖（LPS）所致的小鼠小胶质细胞N9细胞株的激活，减少IL-1β、NO的生成。本实验将进一步研究NPY对体外培养的原代大鼠皮层小胶质细胞的生物活性、小胶质细胞来源的IL-1β生成的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象24h内新生SD大鼠30只(清洁级，河北医科大学实验动物中心提供[动物生产许可证号SCXK(冀)2013-1-03]。主要试剂：小鼠单克隆抗体IBA-1、脂多糖(美国Sigma公司)，FITC标记的山羊抗小鼠IgG(美国Proteintech公司)，胎牛血清、DMEMF12培养液(美国Gibco公司)，BIBP3226（美国Tocris Bioscience公司），神经肽Y (NPY)(美国ENZO公司)，ELISA试剂盒（中国Bio-Swamp公司），GoldViewⅠ型核酸染料（美国Ameresco公司），Trizol(美国 Invitrogen公司)，RT-PCR逆转录试剂盒、RNA酶抑制剂（RNasin）、PCR扩增试剂盒、随机引物(Random primers)（美国Promega公司）。

1.2 小胶质细胞培养参照Nakajima等[7]所述方法。24h内新生大鼠无菌环境下开颅取脑，剥除脑膜及血管，取部分大脑皮质，剪碎用0.125%胰蛋白酶37℃消化15 min，反复吹打成悬液，1000 r/min离心5 min后过滤，弃上清，在沉淀物中加入胶质细胞培养液（胶质细胞培养液为含10%胎牛血清，1U/mL青霉素、100µg/mL链霉素的DMEM/F12培养基制成细胞悬液），接种于250mL培养瓶中，37℃，5%CO2培养。第2天全量换液一次，以后每3d更换1/2体积培养液。培养至第14天，细胞充分分层生长后，置于37℃恒温摇床中180r/min振摇2h，收集细胞悬液，1000r/min离心5min，去上清，用DMEM/F12全培养基吹打成细胞悬液，将细胞调至约1×105/mL，种植到预先铺好多聚赖氨酸的六孔板内，每孔3mL。在恒温培养箱内静置30min后完全换液一次，去除少突胶质细胞，加入DMEM/F12完全培养基继续培养3～5d。

1.3 形态学观察分离纯化好的小胶质细胞分别以1×104个/皿接种于3个预先放置经多聚赖氨酸处理过的盖玻片的3.5cm培养皿，24h后，分别更换为无血清胶质细胞培养液、含脂多糖（LPS）(终浓度为100ng/mL)的无血清胶质细胞培养液、含NPY(终浓度为1µmol/L)及LPS(终浓度为100ng/ mL)的无血清胶质细胞培养液继续培养6h，取出盖玻片，以IBA-1为一抗，行免疫细胞化学染色，荧光显微镜下观察原代大鼠皮质小胶质细胞形态学变化。

1.4 小胶质细胞分组及处理方法将分离纯化好的小胶质细胞以2×104个/孔接种于预铺多聚赖氨酸的24孔培养板用于IL-1β蛋白检测，以5×105个/孔接种于6孔培养板用于IL-1βmRNA的检

测。培养3d后换新鲜无血清胶质细胞培养液培养12h使细胞同步化，然后将细胞分为Control组、LPS组、NPY+LPS组、NPY组和BIBP3226+NPY+ LPS组，每组3个样本。Control组细胞以无血清胶质细胞培养液孵育6h，LPS组细胞以含终浓度为100ng/mL LPS的无血清胶质细胞培养液孵育6h，NPY+LPS组细胞是先以含NPY(终浓度为1µmol/ L)的无血清胶质细胞培养液孵育0.5h，然后加入LPS（终浓度为100ng/mL）继续孵育6h。NPY组细胞以含NPY(终浓度为1µmol/L)无血清胶质细胞培养液孵育6h。IBP3226+NPY+LPS组细胞先用含NPY Y1受体阻断剂BIBP3226(终浓度为1 µmol/L)的无血清胶质细胞培养液孵育0.5h，再加入终浓度为1µmol/L的NPY孵育0.5h，最后加入终浓度100ng/mL的LPS继续孵育6h。

1.5 小胶质细胞培养液中IL-1β蛋白含量的检测取上述各组小胶质细胞培养液，离心后采用ELI⁃SA法检测培养液中IL-1β蛋白含量。

1.6 小胶质细胞中IL-1βmRNA表达水平的检测采用实时荧光定量PCR法检测上述各组小胶质细胞中的IL-1βmRNA表达水平。小胶质细胞加入Trizol（1mL/孔），吹打后移至去核酶的离心管中，静置5min。每管加入0.2mL氯仿，震荡15s，静置5min。12000r/min离心15min，把上层无色液体移到新的离心管中。加入等体积的异丙醇，颠倒混匀。4℃12000r/min离心10min，管底可见羽毛状白色沉淀物，完全弃去上清。加入1mL 75%乙醇（DEPC水配置），洗涤沉淀。4℃7500r/min离心5min，弃上清。静置晾干3～5min，加入20～30 µL DEPC水充分溶解RNA。1%琼脂糖凝胶电泳证实RNA完整性较好，无污染。紫外分光光度计检测RNA浓度。引物由上海生工生物公司合成。IL-1β上游引物5’-CTCCATGAGC TTTGTA⁃CAAGG-3’，IL-1β下游引物5’-TGCTGATGTAC⁃CAGTTGGG-3’，扩展长度为245bp。GAPDH上游引物 5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’，GAPDH下游引物5’-GCTTCACCACCTTCTTGAT⁃GTC-3’，扩增长度为120bp。实时PCR反应中反转录反应体系总RNA 8μL，随机引物1μL，2×ES Reaction Mix 10μL，RT/RI Enzyme Mix 1μL，总体积20μL。扩增体系为：2×UltraSYBR Mixture（with ROX）10μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，cDNA 8μL，总 体 积 20μL。RT-PCR反应程序参数：预变性95℃10min；变性95℃ 15s，退火58℃ 20s，延伸72℃ 27s，40个循环。用ABI 7300 Real-Time PCR System（(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)检测并计算目的基因表达量与内参GAPDH比较的相对值（RQ值），用于统计分析。

1.7 统计学方法利用SPSS10.0进行统计学处理，经正态性检验和方差齐性检验，数据符合正态性和方差齐性的要求，采用完全随机设计的方差分析，进一步的两两比较采用LSD法，数据以±s表示，检测水准α=0.05。

2 结果

2.1 大鼠大脑皮质小胶质细胞的形态学变化无血清培养液孵育的小胶质细胞呈细胞呈分枝状外观，胞体较小，有细长的突起（箭头），细胞表达IBA-1（图1）。含LPS的无血清培养液孵育的小胶质细胞处于活化状态，胞体变为圆形和阿米巴状，突起回缩，IBA-1染色加深（箭头,图2）。提前加入NPY再加入LPS的无血清培养液孵育的小胶质细胞大部分为非活化状态，成多角形，有长的突起（箭头），IBA-1染色阳性，但比LPS组荧光强度明显弱（图3）。

2.2 培养液中IL-1β蛋白含量的变化孵育各组小胶质细胞6h后，LPS组和IBP3226+NPY+LPS组中IL-1β的含量显著高于Control组（F=127.991, P＜0.05）；LPS组和IBP3226+NPY+LPS组之间无显著性差异。LPS+NPY组与LPS组相比，培养液中IL-1β含量显著降低（P＜0.05），IBP3226+NPY+ LPS组与LPS+NPY组相比，培养液中IL-1β的含量显著增高（P＜0.05），NPY组与对照组无统计学意义。见表1。

2.3 小胶质细胞中IL-1βmRNA水平的变化孵育各组小胶质细胞6h后，LPS组和BIBP3226+ NPY+LPS组小胶质细胞的IL-1βmRNA表达水平显著高于Control组（F=42.4712，P＜0.05）；LPS组和IBP3226+NPY+LPS组之间无显著性差异。与

LPS组相比，LPS+NPY组小胶质细胞中的IL-1βmRNA表达水平明显降低（P＜0.05）。与LPS+NPY组相比，IBP3226+NPY+LPS组小胶质细胞中的IL-1βmRNA表达水平显著增高（P＜0.05），NPY组与对照组无统计学意义。见表1。

3 讨论

自从Besedovsky提出了免疫-神经-内分泌调节网络学说以来，免疫在神经系统疾病中的作用受到人们越来越多的关注。小胶质细胞（MG）广泛分布于中枢神经系统，在免疫功能调节方面起着重要作用。很多资料显示小胶质细胞激活和中枢神经系统很多疾病有关，例如阿尔茨海默病、帕金森综合症、脑缺血等中枢神经系统病变[8-10]。MG活化后产生大量细胞因子等生物活性物质，例如IL-1β、TNF-a、NO等，这些物质的大量积聚会对神经元产生毒害作用，这可能是MG活化后导致神经元损伤的重要途径之一。IL-1β是最常见的损伤性细胞因子，也是小胶质细胞激活后释放的前炎症因子，在中枢神经系统多种生理和病理过程中发挥着重要作用。

图1 无血清培养基孵育的小胶质细胞，IBA-1染色后的小胶质细胞，可见长的突起(400×)，标尺为25μm

图2 含LPS的无血清培养基孵育的小胶质细胞，IBA-1染色加深，胞体突起回缩，成圆形或者多角形(400×)，标尺为25μm

图3 含LPS和NPY的无血清培养基孵育的小胶质细胞，IBA-1染色后大部分细胞有长的细胞突起，荧光强度较LPS组明显减弱(400×)，标尺为25μm

表1 各组培养基中IL-1β蛋白含量(±s,n=3)

表1 各组培养基中IL-1β蛋白含量(±s,n=3)

1）与control组比较，P＜0.05；2）与LPS+NPY组比较，P＜0.05

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人体内的神经肽类物质与炎症反应有着较密切的关系。当体内出现炎症反应时会释放一些神经肽类物质，这些神经肽类物质可以下调机体的免疫应答，诱导T细胞的产生，抑制抗原特异性Th1细胞分化，维持机体免疫耐受，减轻炎症反应[11-14]。NPY全名神经肽酪氨酸，是一种广泛存在于中枢神经系统中的神经肽，与癫痫，学习、记忆、摄食和内分泌都有着密切关系。NPY通过与不同的受体结合在体内发挥不同的作用，NPY受体都属于G蛋白的偶联受体，在人体内包括Y1、Y2、Y3、Y4、Y5 5种亚型。第二军医大学周江睿对原代培养的腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞的研究[15]显示，NPY对炎症因子的调节具有双面性，一方面，NPY能够抑制腹腔巨噬细胞释放炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6和前列腺素B2，另一方面，NPY能够促进腹腔巨噬细胞晚期炎症因子HMGB1的分泌。最近Ferreira R等[16-17]研究表明，小鼠小神经胶质细胞株N9细胞表达NPYY1受体，NPY可以抑制LPS所致N9细胞的激活，减少

IL-1β、NO的生成，另一方面，NPY还能抑制N9细胞的吞噬作用和迁移能力，当阻断NPY Y1受体后，这种抑制作用消失。本实验采用LPS为MG的激活剂，在LPS处理MG 6h后，MG处于明显的活化状态，细胞体积增大，突触回缩，由分支状变为圆形、梭形或者阿米巴状，特征性标志物IBA-1免疫染色加深，MG的免疫活性也随之增强，MG培养液中IL-1β含量与MG细胞中IL-1βmRNA表达水平均明显增高，与对照组有显著差异。加入NPY后能够明显抑制LPS对MG的激活作用，使大部分MG处于非活化状态，降低了MG培养液中IL-1β蛋白和MG细胞内的IL-1βmRNA表达水平，使用BIBP3226阻断NPY Y1受体后这种抑制作用完全消失，说明NPY是通过Y1受体起到降低MG的免疫活性，减少MG来源的IL-1β产生。NPY处理非活化的小胶质细胞后，培养液中IL-1βa蛋白及MG细胞内的IL-1βmRNA水平均未发生明显变化，说明NPY对静止期的小胶质细胞影响不大。

本研究表明，NPY对中枢神经系统内的小胶质细胞的免疫活性有调节作用，NPY能下调中枢神经系统内小胶质细胞的免疫活性，抑制IL-1β的产生，这种作用是通过其Y1受体实现的。本研究为NPY以小胶质细胞为靶点治疗与免疫有关的中枢神经系统疾病提供了实验依据。

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The effect of NPY on the activation of microglia and IL-1βproduction

.LI Qijun,XING Zhaoguo,CHANGJunying,WU Yongbo,ZHANG Shuli,WANG Yanzhi,MU Weilu,LI Yan,JIA Dongzhao.Department of Orthopaedic Trauma, the third Hospital of Shijiazhuang city,NO.15,South Sports street,Shijiazhuang 050011，China.Tel:0311-85990917.

ObjectiveTo explore the effect of NPY on activation of primary microglia and the production of in⁃terleukin-1β.MethodsRat primary cortical microglia was cultured and divided into control group,LPS group,NPY+ LPS group,NPY group and BIBP3226+NPY+LPS group.Microglia in control group were incubated with serum-free me⁃dium for 6 h;microglia in LPS group were incubated with serum-free medium plus LPS for 6 h;microglia in NPY+LPS group were incubated with serum-free medium plus NPY and LPS for 6 h;microglia cells in NPY group were incubat⁃ed in serum-free medium plus NPY for 6 h;microglia cells in BIBP3226+NPY+LPS group were incubated in se⁃rum-free medium including BIBP3226、NPY and LPS for 6 h.After 6 h,Primary cultured microglia were stained us⁃ing IBA-1 antibody and examined under the fluorescence microscope.The protein levels of IL-1βin the culture media and the mRNA expression levels of IL-1 βin the microglia of different groups were detected using the methods of Elisa and RT-PCR.ResultsAfter 6 h,the contents of IL-1 βin the culture media and the mRNA expression levels of IL-1 βin the cells of LPS group increased remarkably compared with control group(P＜0.05)and the microglia were activat⁃

Neuropeptide Y MicrogliaInterleukin-1β

R741

A

2014-06-19）

（责任编辑:甘章平）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.03.007

* 石家庄市第三医院创伤一科(石家庄 050011)

△ 石家庄市公安局法医损伤检验鉴定室

※ 秦皇岛市骨科医院药剂科

ed.Compared with LPS group,the contents of IL-1 βin the culture media.the mRNA expression levels of IL-1β and the activity of microglia in LPS+NPY group were significantly decreased.Compared with LPS+NPY group,the contents of IL-1 βin the culture media.the mRNA expression levels of IL-1β and the activity of microglia in BIBP3226+NPY+ LPS group were increased(P＜0.05).There were no significant differences in the contents of IL-1βin the culture media. the mRNA expression levels of IL-1β and the activity of microglia between BIBP3226+NPY+LPS group and LPS group or between NPY group and the control group.ConclusionNPY can inhibit the biological activity of microglia and IL-1βproduction through NPY Y1 receptorin the microglia.