激光酸蚀联合纳米管处理的钛种植体骨结合能力的研究

王敬旭，丁祥龙，容明灯，赵红宇，周 磊

(广东广州 510280:1.南方医科大学附属口腔医院·广东省口腔医院;2.广州医科大学附属第一医院)

激光酸蚀联合纳米管处理的钛种植体骨结合能力的研究

王敬旭1，2，丁祥龙2，容明灯1，赵红宇1，周 磊1

(广东广州 510280:1.南方医科大学附属口腔医院·广东省口腔医院;2.广州医科大学附属第一医院)

目的:研究激光酸蚀联合纳米管种植体(LAN)与喷砂酸蚀种植体(SLA)在不同时期骨结合的差异。方法:取Beagle犬4只，分别在每只犬后腿的左侧胫骨植入4枚LAN处理的钛种植体(LAN组)，右侧胫骨植入4枚SAL处理的钛种植体作为对照(SLA组);分别于术后2、4周各随机处死2只动物，取出胫骨后，采用EXAKT切磨系统制作含种植体的骨组织切片;通过甲苯胺蓝染色法观察各种植体的骨结合情况，并比较两种不同处理方法的种植体在不同时期骨结合的差异。结果:术后2、4周，LAN组的种植体-骨结合率(BIC%)、骨面积百分数(BA%)均高于SLA组(P＜0.05)。结论:激光酸蚀联合纳米管处理的种植体(LAN)相比喷砂酸蚀处理的种植体(SLA)具有更好的骨结合效果。

钛;喷砂;激光;酸蚀;纳米管

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2015，25(6):359］

近年来钛种植技术已成功应用于牙列缺损的修复，且因其手术创伤小、修复效果好，而逐渐取代了传统的修复形式。良好的骨结合是种植体成功修复的前提，而种植体表面是影响骨结合的一个重要因素［1］。本研究在激光酸蚀的基础上，结合纳米管处理的方法制备出激光酸蚀联合纳米管(Laser/acid/nanotuble Modifying，LAN)表面的种植体，并以经典的喷砂酸蚀(Sand Blast and Acid Etching，SLA)表面的种植体作为对照进行研究，以期为寻求更好的种植体表面处理技术奠定基础。

1 材料和方法

1.1 纯钛种植体的制备及其表面粗化处理

取商业Ⅳ级纯钛(深圳市兴宏德金属有限公司)按要求加工成种植体，其具体参数为:长7.8 mm、外径3.5 mm、内径2.0 mm;螺纹为平行的等腰梯形:螺峰宽0.5 mm、高 0.75 mm、螺距 3.0 mm(图 1)。制备完成的种植体用丙酮清除其表面油污，并经超声荡洗后，分别采用LAN制备技术及SLA技术［2］对其表面进行处理。

图1 不同表面实验纯钛种植体的外观形态

1.2 实验动物分组和种植体植入

1.2.1 实验动物和分组

取450～455日龄普通级、健康雄性Beagle犬［许可证号:SCXK(粤)2009-0009，中山大学北区实验动物中心提供］4只(体质量16～17 kg)，经质量检测(合格证编号:4400420000000026，高腰市康达实验动物科技有限公司)合格后，根据不同观察周期(2、4周)将其随机分为2组(n=2)，并按以下方法进行种植体植入。动物手术及饲养管理均在中山大学北区实验动物中心进行。

1.2.2 种植体植入方法

两组动物:肌肉注射1.5 mL速眠新10 min后，再将30g/L戊巴比妥钠按1 mL/kg进行肌肉注射。麻醉成功后，常规备皮、消毒铺巾，并在种植区加必兰1.7 mL进行局麻。在每只犬后腿的左右胫骨前内侧中1/3区段各做一线性切口(长约10 cm，深达骨面)，并翻黏骨膜瓣;然后按临床种植程序分别在两侧胫骨的膝关节端骨骺线下5 mm处起始均匀植入4枚两种不同表面的种植体(左侧为LAN组，右侧为SLA组)，并根据植入位点从上到下依次记为1～4号。最后分层严密缝合伤口，术后3d每天肌注青霉素80万单位。以上操作均由同一位医生完成。

1.3 取材和带种植体的骨片制备

1.3.1 收集种植体标本

分别于术后2、4周处死相应组的Beagle犬，切除术区皮肤及皮下组织，小心分离出原种植区并暴露种植体顶部后，用外科骨锯截取各犬包含有种植体的胫骨上段。清除各胫骨标本表面的软组织，并用生理盐水反复冲洗干净后，立即浸泡于40g/L福尔马林固定液中，置于4℃恒温冰箱保存48～72 h。

1.3.2 带种植体骨切片的制备

1.3.2.1 骨组织的前处理

取上述各胫骨段，流水冲洗24 h后，用骨科锯切割包裹着种植体的骨组织(切割时将胫骨夹固于切片机上)，并使分割的骨组织块露出少许种植体螺纹，大小为10 mm×10 mm×5 mm。按植入顺序对各组织块进行编号标记后，用700～1 000 mL/L的乙醇分别进行梯度脱水;然后将各组织块放入模具中，用甲基丙烯酸甲酯进行浸透包埋(在光固化的包埋机中进行)。

1.3.2.2 组织切片方法

为了确保制作出的骨切片厚度为30 μm，整个过程均采用AW100测量系统(艾卡特，德国)控制。具体制作方法:用粘结剂将包埋好的各标本粘于干洁的载玻片A，并将载玻片A固定在切片机上，分别对载玻片A上的组织块进行修切;修切至充分显露一侧的种植体后，取下载玻片A，再将其固定在磨片机上对标本表面进行抛光;抛光完成后，用胶水将载玻片B黏合在标本的抛光面一侧，使之形成两侧载玻片中间包埋组织标本的双夹结构，然后再将载玻片A侧固定在切片机上，同时将厚度设定为150 μm，并采用自动步进的定位装置控制切割厚度对标本进行切割;将切下的带有厚约150 μm骨切片的载玻片B固定在带有电子测量控制系统和滚动磨盘装置的微磨片机上，并使用各级Al2O3、SiC砂纸依次对切片进行打磨，磨至切片厚度为30 μm时，再用细砂纸依次对切片表面进行抛光。

1.4 骨组织形态计量学指标的测定

取上述制备的所有带种植体的骨磨片，分别经甲苯胺蓝染色后，光学显微镜下进行观察并拍照。然后再用Image-pro Express 6.0图象分析仪测量各骨磨片中新生骨与种植体接触面的总长度和埋入骨组织内的种植体周围长度;并计算其种植体-骨结合率(bone-implant contact，BIC%)和骨面积百分数(Bone area，BA%)。本研究定义BIC为种植体梯形凹槽内骨组织与种植体的结合率;BA定义为种植体梯形凹槽腔内的成骨面积，计算公式如下。

1.5 统计学分析

用SPSS v16.0软件进行统计分析，数据采用均数±标准差(±s)表示。对于单独效应的分析，当数据满足方差齐性和正态性，采用两独立样本t检验，若不满足则采用校正的t检验。对于单变量两因素的数据，若满足方差齐性和正态性，则采用析因设计的方差分析。假设检验为双侧检验，检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 实验动物术后状态观察

所有Beagle犬均于术后1 h内苏醒，未发生死亡。种植体未出现感染排斥现象，手术创口均达到Ⅰ期愈合，实验观察期间发现犬有舔舐术区现象，但无红肿及化脓的感染情况发生。术后7～10d，皮肤缝线自行脱落;术后第1周犬活动有所受限，2周后活动恢复，生活状况正常。

2.2 种植体骨标本的大体观察

所有标本均可见骨组织及纤维组织包裹种植体的顶部，植体无松动，未发现骨吸收现象。术后2周时，两组种植体顶部主要由类骨质和软组织所覆盖;术后4周时，两组种植体顶部主要由疏松的骨质所覆盖，较为成熟的偏淡黄色的骨组织相比2周时明显增多。

2.3 种植体骨切片的染色观察

术后2周时，两类表面处理的种植体均可见稀疏的新生编织骨充满种植体梯形骨缺损区内，大部分的新生骨均沿着种植体螺纹斜面从原骨创面向螺纹的底部生长，新生骨处于编织骨状态，较为稀疏，其间有少量的血管组织(图2)。术后4周时，两类表面处理的种植体均可见新生骨继续沿着种植体的螺纹斜面向种植体表面爬行生长，新生骨的量比2周时明显增多，且成熟度较高，并可见较为成熟形态的骨小梁开始在梯形骨缺损区内形成;在两种种植体的螺纹和斜面的底部均有大量新生骨组织的紧密附着，血管组织也较丰富(图3)。

图3 术后4周时两类表面处理种植体的骨结合情况比较(甲苯胺蓝染色，×40)

2.4 各组种植体不同时段的BIC%和BA%数据测量分析

两类表面处理种植体植入术后2、4周时，LAN组的BIC%、BA%均明显高于SLA组，差异具有统计学意义(P ＜0.05)(表1)。

表1 不同处理种植体表面在术后不同时间BIC%和BA%比较(±s)

表1 不同处理种植体表面在术后不同时间BIC%和BA%比较(±s)

组别 n SLA 2周 4周LAN 2周 4周BIC 8 0.13 ±0.007 0.25 ±0.006 0.20 ±0.011 0.47 ±0.015 BA 8 0.18 ±0.019 0.36 ±0.044 0.28 ±0.043 0.48 ±0.038 t-13.813 -39.657 -5.935 -5.931 P≈0.001 ≈0.001 ≈0.001 ≈0.001

3 讨论

最近的研究表明:种植体表面的不同处理方法对骨结合效能的影响主要表现在骨改建的早期，而在2个月后，光滑对照组与实验组相比则体现不出差别，都能达到良好的骨整合效果［3］。因此，该领域的研究者多选择8周前的阶段做为实验观察时段。虽然更早的观察时间点也可得到不同骨结合的效果，但易造成对比性不明显，从而导致假阴性的结果。故本实验采用2、4周做为观察点，来对比这两种表面处理方法在骨结合方面的差异性。

自Branemark教授提出“骨结合(Osseointegration)”理论［4-5］后，由于没有有力的直接证据，在相当长的时间内，这一观点无法完全让人信服;当时，人们只能通过取出种植体并去除部分软硬组织后才能大致观察分析骨结合的状况，但还无法制取理想的骨和金属联合切片。直到Schroeder发明了一种新的切片技术，并成功制备了满意的骨和种植体联合切片后，才使骨结合的理论得到有力的证实。目前，关于种植体骨结合的组织学观察仍沿用Schroeder的研究方法。

实验表明［6］:EXAKT硬组织切磨系统可制作出高质量的硬组织切片，并能保持组织和种植体之间的结构形态;采用EXAKT切磨系统设备制备出的切片厚度可小于20 μm，且厚度均一，在显微镜下更容易聚焦。

另有研究发现，成骨细胞合成和分泌的骨基质需经过约5～7d的延迟时间，其矿化过程才真正开始;矿化骨与类骨质之间不仅有一过渡区域称分界带，还有一条由骨质颗粒汇合成的线，称之为矿化前缘，甲苯胺蓝染色可以清晰显示出这条位于原骨组织和新生矿化骨基质之间的分界线［7］。因本实验是研究两种不同表面种植体的早期骨结合效能，故选择了甲苯胺蓝染色法。

种植体的表面粗化，不仅可增加其表面张力，促进成骨细胞的吸附、分化、扩增及界面的早期愈合;同时还能增强软骨细胞的分化和扩增。有研究表明:与光滑表面相比，表面粗化的钛种植体可减少种植体周围纤维组织的再生，增强牙种植体-骨的连接，从而获得更大的骨结合面积及更强的抗剪切能力，使骨结合更快更广泛的形成［8］。

喷砂加酸蚀的表面处理是目前种植系统采用最广泛的表面之一，其良好的生物相容性及促骨结合能力已获得公认。关于喷砂加酸蚀处理的钛表面形貌、表面粗糙度、生物相容性及骨的引导性等方面的研究报道都比较详尽。激光能提高金属的耐腐蚀性，并能改善金属表面的物理性能和力学性能，是一种非接触性、高效而干洁的处理方法，与目前主流的微弧氧化、酸蚀、喷砂、喷涂等明显不同。目前激光蚀刻相关的处理表面，也有较多的研究，证实了该方法处理的表面具有较好的生物相容性，并能显著提高种植体的骨扭出力;而激光加酸蚀的表面处理方法，本课题组之前的系列研究表明:以光滑表面的种植体作为对照组时，激光酸蚀表面能获得比光滑表面更快更好的骨结合;以喷砂加酸蚀的种植体作为对照组时，激光酸蚀表面与喷砂加酸蚀表面的骨结合速度及效果没有显著差异性，也就是说激光酸蚀表面与喷砂加酸蚀表面均具有同样优良的种植体表面［9］。

在纯钛表面制备二氧化钛(Ti02)纳米管是一种在钛金属表面加工出的纳米级多孔状结构，是由大量与材料表面相垂直的纳米级管状结构组成，可有效增加种植体的表面积，并增强其表面性能。Brammer等观察到纳米管可促进牛血管上皮细胞的伸展、迁移［10］。Oh S等发现，在具有纳米管形貌的材料表面，成骨细胞的细胞突可伸到纳米管内，并可使成骨细胞的增殖提高 300%～400%［11］。Kubota等发现，植于大鼠股骨的纳米管种植体显示出优良的骨再生效果［12］。以上研究结果均表明，Ti02纳米管结构能促进成骨细胞在种植材料上的初期黏附、增殖，并可促进骨组织的修复再生。本结果也显示，通过激光酸蚀联合纳米管处理可提高钛种植体的表面粗糙度，从而增大了种植体的表面积。

本研究成功的在Beagle犬的胫骨上进行了实验种植体的植入操作，并采用EXAKT切磨系统制作出了较高质量的含种植体的骨组织切片。骨组织学发现:术后2周时，LAN组和SLA组种植体均以引导类骨组织的沉积和矿化，4周时已获得较好的骨结合效果;特别是激光酸蚀联合纳米管处理的表面，因其具有良好的生物相容性和生物活性，更有利于种植体的骨结合，是一种较为理想的表面处理方法。

［1］Albrektsson T，BrÅnemark PI，Hansson HA，et al.Osseointegrated titanium implants.Requirements for ensuring a longlasting，direct bone-to-implant anchorage in man［J］.Acta Orthop Scand，1981，52(2):155-170.

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Osseointegration effects of laser/acid/nanotube-treated titanium implant surface

WANG Jing-xu*，DING Xiang-long，RONG Ming-deng，ZHAO Hong-yu，ZHOU Lei
(*Center of Oral Implantology，Guangdong Provincial Stomatological Hospital＆the Affiliated Stomatological Hospital of Southern Medical University，Guangzhou 510280，China)

AIM:To compare the osseointegration effects of laser/acid/nanotubes-treated(LAN)and sandblasted/acid-treated(SLA)titanium implant surfaces.METHODS:4 LAN implants were embedded in the left tibial bone of 4 Beagledogs，while 4 SLA implants were embedded in the right tibial bone of thedogs.At 2 and 4 w after operation，2 animals were sacrificed respectively and the tibial bones were taken.Bone ossointegration was observed by histological method.RESULTS:The percentage of bone area(BA)and bone-implant contact(BIC)in LANgroup were significantly higher than those in SLAgroup at both 2 and 4 w(P ＜0.05)after implantation.CONCLUSION:Laser/acid/nanotube-treated implants are more effective for ossoingrationthan than sandblasted/acid-treated implants.

titanium;sandblast;laster;acid;nanotubes

R783.1

A

1005-2593(2015)06-0359-05

10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.06.006

2015-03-15;

2015-04-29

国家自然科学基金(81170998)

王敬旭(1978-)，男，汉族，河南周口人。博士，副主任医师

周 磊，E-mail:zho668@263.com