新型抗菌仿生硅化胶原支架的制备

任高彤，孙佳琦，柴治国，焦 凯，沈丽娟，牛丽娜，陈吉华

(陕西西安，710032:1.第四军医大学口腔医学系;2.军事口腔医学重点实验室，陕西省口腔医学重点实验室，第四军医大学口腔医院:*修复科，＊＊口腔解剖生理学教研室)

新型抗菌仿生硅化胶原支架的制备

任高彤1，孙佳琦2*，柴治国2*，焦 凯2＊＊，沈丽娟2*，牛丽娜2*，陈吉华2*

(陕西西安，710032:1.第四军医大学口腔医学系;2.军事口腔医学重点实验室，陕西省口腔医学重点实验室，第四军医大学口腔医院:*修复科，＊＊口腔解剖生理学教研室)

目的:制备抗菌仿生硅化胶原材料。方法:使用浊度分析确定稳定的正硅酸矿化液中葡萄糖酸氯己定的最小有效浓度，用氯己定稳定的硅酸前体液，对胶原海绵进行仿生硅化处理，并通过傅里叶红外光谱仪分析及透射电子显微镜(TEM)观察确定硅化效果。结果:20g/L的葡萄糖酸氯己定可使正硅酸稳定3d而不发生凝胶化，以此为矿化液可使经聚丙烯氯化铵处理的胶原支架发生纤维内硅化。TEM观察结果显示，纤维内矿物质充实了胶原纤维内部空隙，傅里叶红外光谱分析中的C=C伸缩振动峰表明，在仿生硅化胶原引入了葡萄糖酸氯己定，形成抗菌仿生纤维内硅化胶原。结论:以胶原为模板、聚丙烯氯化铵为催化剂、氯己定稳定的硅酸前体液为矿化基材，成功制备了新型抗菌仿生硅化胶原支架。

氯己定;抗菌材料;纤维内硅化;胶原

焦 凯，E －mail:kjiao1@fmmu.edu.cn

随着外伤、肿瘤、先天畸形等原因造成的骨组织缺损不断增加，人们对植骨材料的需求也日益增多，资料显示，目前全球每年的植骨手术达到近220万例，植骨手术的费用则达到近25亿美元［1］。感染性骨缺损及植骨部位术中、术后感染的发生已成为导致植骨失败的主要原因之一，如在下颌骨缺损的骨移植修复中，有10%～20%的病例因感染而导致植骨失败［2］。长期以来，研制具有抗菌功能的生物材料替代自体骨修复骨缺损一直是医学和材料学领域的重要课题［3］;如何克服植骨部位的感染已成为骨缺损修复领域内的研究热点，而人体口腔的多细菌环境则对颌面部植骨材料的抗菌性能提出了更高要求。氯己定作为一种阳离子表面活性剂，由于其具有广谱杀菌及抑菌作用、不易产生耐药性等特点，广泛用于口腔内感染的治疗，已成为与植骨材料相复合，使植骨材料具备抗菌性能的理想选择。

在本课题组的前期研究中，我们基于聚胺诱导硅酸前体胶原内仿生硅化的理念，以胶原为模板、聚丙烯氯化铵为催化剂、氯化胆碱稳定的硅酸前体液为矿化基材，制备了纤维内硅化胶原［4］。该材料不仅具有良好的生物相容性和机械性能，更具有良好的促进成骨成血管作用［5］，属于较理想的植骨材料，但这种材料仍不具有抗菌性。

为进一步改善纤维内硅化胶原材料的性能，本研究使用氯己定替代氯化胆碱，将抗菌剂氯己定整合入纤维内仿生硅化胶原材料内部，使抗菌成分缓释与植骨材料降解同步化，实现纤维内仿生硅化胶原材料的抗菌功能化转变，并构建有自主抗菌功能的对骨再生、血管形成具有促进作用的抗菌仿生硅化胶原植骨材料，从而为颌面部感染性骨缺损的修复提供更好的解决途径。

1 材料和方法

1.1 稳定硅酸前体液的制备

室温下将正硅酸四乙酯(Silbond 40，Silbond公司，美国)、无水乙醇、去离子水及370g/L盐酸按15∶182.8 ∶2.167 ∶0.008 的质量比(摩尔比为1.875 ∶396.79 ∶12.03 ∶0.0218)在磁力搅拌器搅拌情况下混匀1 h，使正硅酸乙酯在酸性条件下水解为正硅酸及其低聚体。将此正硅酸液与0、5、10、20、40、80 g/L 葡 萄 糖 酸 氯 己 定(C22H30Cl2N10 －2C6H12O7，C9394，Sigma－Aldrich，美国)按1∶1的体积比均匀混合后，分别将其pH值调至5.5，3 000 r/min离心3 min，取上清进行浊度分析。

1.2 浊度分析

上述各溶液于37℃、100%湿度条件下孵育0、0.5、1、3、5、12、24、48、72、96、128 h 后，采用多功能酶标仪(波长405 nm)进行浊度分析(n=8)，溶液吸光度达到稳定水平的时间为其凝胶时间。根据实验结果，从中选取能够使正硅酸液在pH=5.5、37℃条件下稳定3d，而不发生凝胶化的最小葡萄糖酸氯己定浓度(20g/L)为后续实验的工作浓度。

1.3 重组I型胶原海绵的仿生硅化

将重组胶原海绵修剪为直径10mm、厚度2mm的胶原块，用Milli－Q 水(18.2 mΩ－cm)冲洗3次后置于6.67×10－4mol/L聚丙烯氯化铵(Sigma－Aldrich，美国)液中浸泡4 h。Milli－Q水反复冲洗后，将经聚丙烯氯化铵处理的胶原块置于1 mL上述制备的硅化液中孵育4d，每天换液1次。

1.4 衰减全反射－傅立叶变换红外光谱术

仿生硅化处理4d后用去离子水反复冲洗仿生硅化胶原支架，无水硫酸钙中干燥24 h。使用傅立叶变换红外光谱仪(Thermo Scientific，美国)，并通过衰减全反射变换红外光谱技术，分别采集葡萄糖酸氯己定和仿生硅化胶原支架的红外光谱，以鉴定硅化胶原支架表面官能团。设定光谱收集范围为400～4 000 cm－1，扫描次数为32，分辨率为4 cm－1。

1.5 硅化胶原的透射电镜(TEM)观察

分别将仿生硅化处理2、4d的胶原支架用去离子水反复冲洗后，梯度乙醇(500、700、800、950、1 000 mL/L)脱水，环氧丙烷及树脂浸透后，100%树脂包埋，56℃烤箱烘干24～48 h后形成包埋块。二次包埋后使用 UM UC6切片机(莱卡，德国)制备70～90 nm厚的电镜切片，并使用 JEM－1230透射电镜(JEOL公司，美国)进行观察。

2 结果

2.1 凝胶时间

正硅酸与不同浓度的葡萄糖酸氯己定按1∶1的体积比均匀混合后浊度分析结果如图1。当氯己定的浓度低于10g/L时，正硅酸均在2d内发生凝胶化，而20、40、80g/L葡萄糖酸氯己定均可使正硅酸稳定3d而不发生凝胶化，故选取20g/L的葡萄糖酸氯己定为后续实验的工作浓度。

图1 葡萄糖酸氯己定浓度对正硅酸的稳定性的影响(n=8)

2.2 傅里叶红外光谱分析

仿生硅化胶原的红外光谱中，1 650、1 550 cm－1处分别对应胶原分子中酰胺Ⅰ的C=O伸缩峰、酰胺Ⅱ的NH弯曲和CN伸缩峰。葡萄糖酸氯己定中1650、1550 cm－1处的NH弯曲峰分别与仿生硅化胶原的红外光谱中酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ重叠。硅化处理在胶原支架中引入了水合二氧化硅的特征峰:460 cm－1处对应 Si－O－Si横向光学摇摆运动模式(TO1模式);800 cm－1处对应 Si－O－Si(TO2模式);1 070 cm－1处对应非对称伸缩的Si－O－Si峰(TO3模式);940～960 cm－1对应Si－OH振动峰。仿生硅化胶原中1 486cm－1处的峰对应于苯环中的C=C伸缩振动峰，表明在仿生硅化胶原引入了葡萄糖酸氯己定(图2)。

2.3 TEM 观察

以10g/L的葡萄糖酸氯己定稳定的正硅酸为矿化液，其所制备的硅化胶原TEM观察结果如图3。仿生硅化处理2d，胶原纤维束内有部分高电子密度矿物质沉积(图3a)，高倍显示，矿物质沉积使胶原纤维的节律性横纹结构清晰可见(白色箭头所示)(图3b);仿生硅化处理4d，整个胶原纤维束呈现高电子密度的状态(图3c)，表明有大量矿物质沉积，高倍可见胶原横断面内为矿物质充实(白色箭头所示)(图3d)。

图2 葡萄糖酸氯己定及仿生硅化胶原支架的傅里叶红外光谱图

图3 硅化胶原的TEM观察结果(白色箭头示节律性横纹结构)

3 讨论

由于在感染性骨缺损的治疗中，全身用药存在局部药物浓度低、全身毒副作用大、治疗时间长且费用高等缺点，因此，兼具良好成骨活性和局部抗感染能力的新型植骨材料的研发具有很大的临床应用价值和社会经济效益［6］。在本课题组的前期研究中，以引导组织再矿化的理念为指导、聚胺诱导的液相硅酸纳米颗粒为前体，首次实现了三维重组I型胶原纤维内的仿生硅化［4］。在以往的研究中，胶原类材料虽然具有良好的生物相容性和成骨活性，但由于较差的机械性能而被认为不宜单独用于修复骨缺损［7］。而本课题组合成的纤维内仿生硅化胶原，不仅具有胶原类材料良好的生物相容性和生物活性，更由于胶原纤维内部仿生硅化而具有良好的机械性能［4－5］。进一步研究表明，加载有细胞归巢因子SDF－1的纤维内仿生硅化胶原具有良好的促进成骨成血管的作用［4］。

本研究在纤维内仿生硅化胶原的研究基础上，创新性地将引导组织再矿化理念与抗菌功能化修饰相结合，将抗菌剂氯己定整合入纤维内仿生硅化胶原材料内部，完成对纤维内仿生硅化胶原材料的抗菌功能化修饰，以赋予其良好的抗菌性能。由于20g/L的葡萄糖酸氯己定能够使正硅酸在pH=5.5、37℃ 条件下稳定3d，不发生凝胶化，使得我们能够用葡萄糖酸氯己定取代氯化胆碱，达到稳定液相硅酸前体的目的，使其有充足的时间渗透入胶原内部。随后我们使用聚丙烯氯化铵聚阳离子对胶原纤维进行预处理，使其与胶原纤维表面阴性电荷位点结合，形成富含多聚阳离子的胶原纤维内环境，从而有利于吸引并促进带负电荷的液相硅酸纳米颗粒对胶原纤维粘附、渗透，进而占据胶原纤维内部空隙，在硅化早期可见纤维内二氧化硅的沉积使胶原纤维的节律性横纹结构清晰(图3b)。随着硅化时间的延长，液相硅酸纳米颗粒进一步渗透胶原内间隙并缩聚为无定形水合二氧化硅，从而充满纤维内间隙(图3d)。傅里叶红外光谱分析证实所引入矿物质为无定形水合二氧化硅，并且C=C伸缩振动峰的出现表明仿生硅化胶原引入了葡萄糖酸氯己定［4］。

氯己定作为一种阳离子表面活性剂，能够有效地去除菌斑，在口腔治疗中被认为是衡量其他抗菌斑、抗龈炎药物的金标准［8］，并且通过与软硬组织的吸附结合，在局部保持长时间的有效抗菌浓度［8］。其杀菌机制为:氯己定吸附于细胞壁，改变细菌细胞壁表面结构与渗透平衡，使胞浆成分渗漏，高浓度时可使胞浆凝固，抑制细胞壁的修复。具有广谱杀菌、抑菌作用的氯己定，其作用方式不易产生耐药性，且毒理学安全性评价显示其无毒性、无刺激性［9］，能够在感染性骨缺损的修复中很好地完成抗菌任务。本课题组的前期研究中，纤维内仿生硅化胶原材料能够缓慢地释放硅酸。并且加载有SDF－1的纤维内仿生硅化胶原，在硅酸缓慢释放的同时SDF－1也随之缓慢释放，且SDF－1的释放规律与硅酸相似［5］。而在本实验所制备的抗菌纤维内仿生硅化胶原中，由于氯己定伴随着液相硅酸前体渗透进入胶原纤维内部，因此我们设想，在活性硅酸从胶原纤维内部释放的同时，氯己定也会随之缓慢释放，从而在发挥抗菌作用的同时，使抗菌成分缓释与植骨材料降解同步化。未来我们将重点进行该方面的研究。

在引入氯己定构建新型抗菌纤维内仿生硅化胶原材料后，氯己定的引入是否会对纤维内仿生硅化胶原的理化机械性能与对成骨成血管的促进作用造成影响;整合进入胶原纤维内部的氯己定是否能发挥有效的抗菌作用，以及氯己定发挥抗菌作用的时效性;是否能够做到抗菌成分氯己定缓释与植骨材料纤维内仿生硅化胶原降解同步化，都有待于本课题组进行进一步深入的研究。

本实验以胶原为模板、聚丙烯氯化铵为催化剂、氯己定稳定的硅酸前体液为矿化基材，制备了纤维内硅化胶原支架。这种材料不仅具有良好的生物相容性和机械性能，更具有良好的促进成骨成血管的作用，同时氯己定的引入有可能赋予其良好的抗菌效果，在后期的研究中我们将针对这种新型材料的抗菌性能展开研究。

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Development of a novel antibacterial intrafibrillar－silicified collagen scaffold

RENgao－tong*，SUN Jia－qi，CHAI Zhi－guo，JIAO Kai，SHEN Li－juan，NIU Li－na，CHEN Ji－hua
(*Undergraduatedepartment of Oral Science，Fourth Military Medical University，Xi＇an 710032，China)

AIM:Todevelop a novel antibacterial intrafibrillar－silicified collagen scaffold.METHODS:Silicic acid solution was prepared by hydrolyzing tetraethyl orthosilicate.A chlorhexidine stabilized silicic acid was prepared and used as silicifying medium.Gelling time test was used todetermine the minimum concentration ofgluconic acid chlorhexidine that was able to stabilize silicic acid for 72 hours.The reconstituted type I collagen spongedisc was pretreated with 6.67 ×10－4M poly allylamine hydrochloride for 4 h and then placed in the silicifying medium for 4d to produce silicified collagen scaffold.Attenuated total reflection－fourier transform infrared spectroscopy(ATR－FTIR)and transmission electron microscopy(TEM)were used to characterize the antibacterial intrafibrillar－silicified collagen scaffold.RESULTS:2.0%gluconic acid chlorhexidine could stabilize the silicic acid for 3d withoutgelation and was used as silicifying medium.With this method，silicic acid could infiltrate into the inside space of the type I collagen and then condense into orderlydeposited silicondioxideinside collagen fibrils，resulting in intrafibrillar－silicified collagen scaffolddoped with chlorhexidine.FTIR confirmed the incorporation of silica and chlorhexidine in the scaffold.CONCLUSION:A novel antibacterial intrafibrillar－silicified collagen scaffold isdeveloped with reconstituted type I collagen sponge pretreated by poly allylamine hydrochloride and silicic acid stabilized bygluconic acid chlorhexidine.

chlorhexidine;antibacterial materials;intrafibrillar－silicified;collagen

牛丽娜，E－mail:niulina831013@126.com

R783.1

A

1005－2593(2015)06－0363－04

10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.06.007

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2015，25(6):363］

2015－01－25;

2015－04－01

国家自然科学基金(81130078，81400555)

军队青年培育项目(13QNP138)

教育部创新团队(IRT13051)

任高彤(1990－)，男，汉族，河南辉县人。本科生(导师:焦凯)

·治疗与应用·