磁性纳米多孔复合材料的致突变试验研究

黄义鸿 朱伟民 王大平

·短篇论著·

磁性纳米多孔复合材料的致突变试验研究

黄义鸿 朱伟民 王大平

目的 从遗传毒理学方面了解并评价磁性纳米多孔复合(Nano-HA/PLLA/Fe2O3)材料的生物相容性, 从而为其在移植肌腱固定的临床运用提供依据。方法 用Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性纳米复合界面固定材料制备混悬液, 进行Ames致突变试验, 以检测其对鼠伤寒沙门菌的致突变比值(实验组回变菌落数/阴性对照组回变菌落数)。结果 4个菌株在各个受试浓度待测液在加S9与不加S9的情况下, 致突变比值即实验组回变菌落数与阴性对照组回变菌落数的比值(Rt/Rc)均<2.0, 而阳性对照组致突变比值则均>2.0。结论 Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性纳米复合界面固定材料不引起鼠伤寒沙门菌的回复突变数增加, 说明此材料无致基因突变性。

磁性纳米多孔复合材料；致突变试验

本研究通过低温快速成型仪将Nano-HA、PLLA、Fe2O3这三种材料复合制备得到Nano-HA/PLLA/Fe2O3支架材料,并参照国内外对生物材料评价方面的有关标准, 拟通过Ames试验从遗传毒理性方面来评价此Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性纳米复合界面固定材料的生物相容性, 从而为其运用于前交叉韧带重建术中移植肌腱界面固定的临床应用提供安全性依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 本实验所用的Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性纳米复合界面固定材料由深圳市第二人民医院组织工程重点实验室与中国科学院深圳先进技术研究院联合研制, 立方体(25 mm× 25 mm×25 mm)。Nano-HA/PLLA/Fe2O3材料先用紫外线照射30 min, 经磷酸盐缓冲液(PBS液)浸泡、清洗, 75%乙醇浸泡消毒后干燥备用。

1.2 实验方法 取Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性纳米复合界面固定材料, 按重量比以2.5%羟甲基纤维素钠溶液配成5 mg/ml, 0.5 mg/ml及0.01 mg/ml三种不同浓度的混悬液受试。菌种采用由美国Ames实验室提供并由湖南省疾病控制中心繁殖保存的鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型菌株(TA-97、TA-98、TA-100和TA-102), 经性状鉴定合格后进行实验。由于Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性纳米复合界面固定材料是用于人体内植入的, 植入人体后肝细胞微粒体酶系(S9)就有可能诱变HA(假如HA有诱变作用), 而细胞体内无此酶, 为了使实验条件更接近体内环境, 将培养板分为活化实验组(加S9溶液)和非活化实验组(不加S9溶液)。大鼠肝脏微粒体酶系(S9)由多氨联苯诱导, 制成肝匀浆后-80℃冰箱内保存,使用时用2-氨基芴测定其活力。实验用柔毛霉素(浓度为25 μg/0.1 ml)作为菌株培养时的直接致突变活性指示(不加S9), 2-氨基芴(50 μg/0.1 ml)作为菌株的间接致突变活性指示(加S9)；以叠氮化钠(5 μg/0.1 ml)作为阳性对照, 以同样体积生理盐水作为阴性对照。每个菌种的各个剂量组均各设3个平行皿。

通过平板渗入法将不同浓度组混悬液与菌株在最低营养板上混合培养, 经37℃培养48 h后, 分别进行观察回变菌落数结果。每组取其3个平行培养皿的平均回变菌落数, 依据出现的致突变比值(如下式计算)检测Nano-HA材料制品中是否存在诱变物质。

致突变比值(MR)= 实验组回变菌落数(Rt)/ 阴性对照组回变菌落数(Rc)

2 结果

4个菌株在各个受试浓度待测液在加S9与不加S9的情况下, 致突变比值即实验组回变菌落数与阴性对照组回变菌落数的比值(Rt/Rc)均<2.0, 而阳性对照组致突变比值则均>2.0, 据此可以认为Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性纳米复合界面固定材料在Ames试验中无致突变性。

3 讨论

生物相容性是指材料与人体之间相互作用产生各种复杂的生物、物理、化学反应, 以及人体对这些反应的忍受程度［1,2］。根据ISO10993标准的要求, 生物医学材料长期接触人体或植入人体内组织、血液应进行潜在的遗传毒性方面的生物学评价试验。Ames试验是由美国的B.N.Ames在1975年建立的鼠伤寒沙门菌回复突变试验, 是一种已被公认并广泛开展的致突变鉴定方法。此方法能够在短期内检测医用材料有无致突变性。

本实验将Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性纳米复合界面固定材料浸提液与各标准菌液混合后在最低营养板上培养, 依据出现的回变菌落数及致突变比值来判断复合人工骨是否存在诱变物质。考虑到材料是用于植入人体的, 为使实验条件更接近体内环境, 以排除人体肝细胞微粒体酶系(S9)可能造成的激活诱变作用(间接诱变), 使得实验更具可信度, 作者在实验中对把材料浸提液的检测分为S9(+)组和S9(-)组, 观察用S9诱发后回变菌落数有无增加。另外, 在操作及观察结果过程中注意严格无菌操作以排除杂菌污染, 进而保证本试验结果的可靠性。

本试验结果显示, 各菌株在各浓度待测液组中回变菌落平均数均未超过其相应阴性对照组回变菌落平均数的2倍(MR<2), 显示该材料在有、无S9的情况下均无诱变活性；而阳性对照组各菌株回变菌落平均数均超过其相应阴性对照组回变菌落平均数的2倍以上(MR>2), 证实鼠伤寒沙门菌的组氨酸营养缺陷型突变菌株对受试物的检测有效。本实验说明此Nano-HA人工骨材料无遗传毒性作用, 其用于体内植入是安全的, 这为进一步动物实验及临床应用提供了依据。

［1］ 郝和平.医疗器械生物学评价标准实施指南.北京:中国标准出版社, 2002:81-135.

［2］ 中华人民共和国卫生部药政管理局.生物材料和医疗器材生物学评价技术要求.北京:人民卫生出版社, 1997:502-523.

Research of mutagenicity test for magnetic nanometer perforated composite materials

HUANG Yihong, ZHU Wei-min, WANG Da-ping.Department of Rheumatology, Shenzhen City the Second People’s Hospital, Shenzhen 518035, China

Objective To understand and evaluate the biocompatibility of magnetic nanometer perforated composite materials (Nano-HA/PLLA/Fe2O3) by genetic toxicology, in order to provide reference for its clinical application in tendon transplantion fixation.Methods Suspension was made by Nano-HA/PLLA/Fe2O3magnetic nanometer composite interface fixation material for Ames mutagenicity test, in order to detect its mutagenicity ratio (number of revertant bacterial colony in research group/number of revertant bacterial colony in negative control group) for salmonella typhimurium.Results All the 4 strains in different tested concentrations with or without S9 had mutagenicity ratio as number of revertant bacterial colony in experimental group/number of revertant bacterial colony in control group (Rt/Rc) <2.0, while the ratio with positive control group was >2.0.Conclusion Nano-HA/PLLA/Fe2O3magnetic nanometer composite interface fixation material will not induce increasing number of revertant mutation, which suggests this material contains no mutagenicity.

Magnetic nanometer perforated composite material; Mutagenicity test

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.17.017

2015-02-04］

深圳市科技研发资金项目(项目编号：CXZZ 20130321152713220)；广东省卫生厅医学科研基金项目(项目编号：B2012320)；广东省教育厅育才项目(项目编号：2012LYM_0120)

518035 深圳市第二人民医院风湿免疫科