PSD-95抑制剂在缺血性脑损伤后的神经保护作用

欧阳馥冰陈艺聪曾进胜

·综 述·

PSD-95抑制剂在缺血性脑损伤后的神经保护作用

欧阳馥冰*陈艺聪*曾进胜*

脑缺血 神经保护药 PDZ结构域

迄今绝大多数在脑缺血动物模型中证实有效的神经保护药物，进入临床试验后都被证实无效甚至有害[1]。近年来，突触后致密物-95（postsynaptic density-95，PSD-95）抑制剂成为神经保护治疗研究的新热点。本文对PSD-95抑制剂Tat-NR2B9c（NA-1）从离体细胞、啮齿类动物、非人灵长类动物到人体试验的研究进展进行综述。

1 离体细胞中证实抑制PSD-95可减轻缺血性神经元损伤

PSD-95是一种细胞脚手架蛋白，通过其氨基端2个PDZ结构域与N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-as⁃partate receptor，NMDAR）的NR2亚基羧基端结合，将NM⁃DAR锚定在突触后膜活性区，并募集细胞质的神经元一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOs），使其移位到细胞膜上，形成NMDAR/PSD-95/nNOs蛋白三聚体[2]。急性脑缺血时，NMDAR过度激活介导的Ca2+内流可激活Ca2+依赖的nNOs，催化生成NO，最终产生大量自由基[3]。

Michelle Aarts等[3]利用NR2B亚基羧基端的9个氨基酸与Tat转导肽融合产生一种PSD-95抑制剂Tat-NR2B9c（NA-1）。体外实验证实该多肽分子能穿透细胞膜，干扰PSD-95与NMDAR的结合，减少NO的生成（图1）。NO和自由基生成的减少，有助于减轻线粒体损伤和ATP消耗，提高细胞存活率[4]。NA-1不影响NMDAR的表达、NMDAR介导的Ca2+内流及细胞质内nNOs的正常功能，可避免直接阻断NMDAR及抑制nNOs活性造成的不良反应[2-3]。

NA-1还可通过激活钙调蛋白激酶IV（calmodulin ki⁃nase IV，CaM IV）依赖的cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB），促进神经营养及神经保护基因的转录与表达[5]。这提示PSD-95抑制剂可通过影响NMDAR下游的其他信号传导通路发挥神经保护作用。

2 PSD-95抑制剂缩小大鼠脑梗死灶体积并改善神经功能

在啮齿类动物中，NA-1经外周静脉注射后能通过完整的血脑屏障[3]。Michelle Aarts等[3]在短暂性大脑中动脉阻塞（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）大鼠模型中证实，卒中前45 min、卒中后1 h单次静脉注射NA-1（7.5 mg/kg），卒中后24 h脑梗死灶体积较对照组明显减小（约54.6%、67.0%），伴随神经功能的改善。

为进一步探讨不同梗死严重程度、性别及给药时间窗对NA-1神经保护作用的影响，Sun等[6]进行了一系列相关实验。实验1选用雌、雄大鼠，开颅电凝一侧大脑中动脉3支软脑膜分支，此法梗死灶较小，程度轻，且不影响卒中后动物的体温。卒中后1 h单次给药，24 h后雌、雄大鼠梗死灶体积均较对照组减少约60%，提示NA-1在不同性别的啮齿类动物中均有神经保护作用。实验2制备永久性大脑中动脉阻塞（permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO）模型，此法梗死灶大，神经功能缺损严重，死亡率较高，无法观察长期神经功能变化，且术后大鼠核心温度迅速升高，24 h内维持在高于39℃的水平，这与临床卒中后常见的高热并发症相似。卒中后1 h给药使24 h梗死灶体积减少约40%，提示NA-1在梗死程度重、合并高热的情况下仍起作用。实验3制备tMCAO模型，给药时间窗延长至卒中后3 h，观察终点延长至卒中后62 d。结果发现卒中后24 h及62 d梗死灶体积分别减小了50%及80%，伴随神经功能恢复，提示NA-1给药时间窗可延长至卒中后3 h并改善近、远期神经功能。

图1 Tat-NR2B9（NA-1）可与PSD-95的PDZ1或PDZ2结合，干扰蛋白三聚体NMDAR/PSD-95/nNOs的形成，阻断兴奋性毒性信号的转导[3]

除了证实NA-1的有效性，研究人员还利用啮齿类动物模型进一步探讨NA-1的作用机制。Bernt T.Bråtane等[4]在大鼠卒中后多个时间点进行核磁共振灌注加权成像（perfusion weighted imaging，PWI）和弥散加权成像（diffu⁃sion weighted imaging，DWI），通过DWI与PWI的不匹配观察缺血半暗带的变化，结果发现NA-1在不增加局部脑血流量的情况下明显延缓缺血半暗带的进展，提示NA-1有可能延长溶栓治疗时间窗。

虽然NA-1在啮齿类动物中展现了良好的神经保护作用，但啮齿类与灵长类动物在神经解剖、生理等方面的差异，可造成两者对药物反应性不同[7-8]。根据2009年卒中治疗学术行业圆桌会议（Stroke Therapy Academic Industry Roundtable，STAIR）的建议，除了啮齿类动物，神经保护治疗需要在与人类有更高相似程度的多脑回（gyrencephalic）非人灵长类动物（nonhuman primates，NHPs）中得到研究[9]。

3 非人灵长类脑缺血动物模型中PSD-95抑制剂的神经保护作用

NHPs研究多以狒狒为模型，其脑血管侧支循环丰富，为提高模型制备的成功率，需同时闭塞一侧大脑中动脉和双侧大脑前动脉。此法梗死灶较大，急性期死亡率高，并影响狒狒的双目视力，不利于行为学检测[8]。狨猴也常用于复制脑梗死模型，但其属于缺脑回（lissencephalic）动物[8]。食蟹猴大脑无丰富的侧支循环，属多脑回，其脑组织和血管解剖与人类较相似。因此，Douglas J.Cook等[10]选择食蟹猴（cynomolgus macaque）进行NA-1的相关研究，分别进行以下4个实验。

实验1夹闭发出眶额支近端，制备90 min tMCAO模型。卒中后1 h单次注射NA-1（2.6 mg/kg），卒中后4 h、24 h及30 d利用DWI、T2WI及组织学方法测量梗死灶大小，同时利用NHPSS（Nonhuman Primate Stroke Scale）评价神经功能，结果发现卒中后24 h及30 d梗死灶体积较对照组减少55%和70%，伴随神经功能改善。实验2夹闭眶额支远端，制备pMCAO模型。卒中后1 h、6 h取缺血半暗带组织活检，提取其神经元RNA行全基因组表达谱芯片杂交，证实NA-1有助于缺血神经元保持内源性保护性基因的转录功能。实验3与实验4通过动脉瘤夹的关闭和开放复制4.5 h及3.5 h tMCAO模型，模拟临床溶栓后再灌注。分别于卒中后1 h及3 h给药，结果发现给药组梗死灶体积较对照组明显减小，伴随神经功能改善，提示NA-1有可能与rt-PA联用并延长其治疗时间窗。

该研究是目前开展的最大样本（n=62）NHPs研究，首次应用MRI技术评价NHPs的缺血半暗带，并模拟临床应用的NIHSS(National Institute of Health Stroke Scale)，采用NHPSS对NHPs卒中后近、远期神经功能进行综合评价。研究仍存在一些问题：①平均每组的样本量仍较少（n= 6-7），存在一定的抽样误差；②研究选择的是雄性、年轻、健康、无并发症的动物，与多有血管基础病变的临床实际不符，应考虑选择不同性别、年龄及健康状态的动物；③NHPSS评分的可靠性尚未得到充分肯定；④需要在血栓栓塞性脑卒中动物模型中进一步探讨NA-1与rt-PA联合治疗的可能[11-12]。

Douglas J.Cook等[13]还根据当时正在进行的临床试验ENACT（Evaluating Neuroprotection in Aneurysm Coiling Therapy），设计了另一项NHPs研究。实验人员从食蟹猴颈内动脉注射多聚乙烯微球制备多发性脑栓塞模型，模拟人颅内动脉瘤介入术后继发的医源性栓塞，1 h后单次给药，24 h及30 d后利用MRI和组织学检查，发现NA-1可明显减少卒中病灶数目和大小（约64%、64%）。此结果与ENACT基本一致，提示该灵长类动物模型实验结果对临床试验结果预测是有效的，该模型可能也适用于其他神经保护药的研究。

4 临床研究初步证实PSD-95抑制剂的有效性和安全性

与Douglas J.Cook模拟颅内动脉瘤介入术后继发脑栓塞的NHPs研究相对应，自2008年到2011年开展了一项II期、多中心、随机、双盲、安慰剂对照临床试验ENACT（ClinicalTrials.gov.Indentifier：NCT00728182），初步证实NA-1在防治颅内动脉瘤介入术后继发脑栓塞的有效性和安全性。此项研究共入组185例患者，包括颅内动脉瘤未破裂或已破裂继发蛛网膜下腔出血，在行血管介入术后马上静脉给予NA-1（2.6mg/kg），12～96 h内进行MRI检查，发现NA-1可减少继发卒中的病灶数量，但对病灶大小没有影响。而亚组分析显示，NA-1不仅能减少动脉瘤破裂组卒中病灶数量，还能减小病灶体积。但该亚组样本量不足（n=37）。研究过程中，NA-1给药组未出现明显的毒副反应，部分患者在给药后24 h出现短暂的低血压（舒张压下降约9 mmHg），但数分钟内自行恢复[14]。

临床上，除了颅内动脉瘤介入术，颈内动脉内膜剥脱术、颈内动脉支架植入术、房颤射频消融术等都有出现继发医源性栓塞的风险[15-16]。这种类型的卒中一般累及终末小动脉，无明显的感觉运动功能缺失，因此未引起足够重视。但严重的多发小梗死灶可损害认知功能，造成血管性痴呆[17]。在这些患者中，NA-1能做到术后早期给药以发挥神经保护作用，具有良好的发展前景。

5 问题与展望

PSD-95为卒中后神经保护治疗提供了一个新靶点。PSD-95抑制剂通过特异性地干扰PSD-95与NMDAR及其下游信号分子的结合，阻断兴奋性毒性信号的传导，从离体细胞实验到小样本人体试验均显示出良好的神经保护作用，其研究成果对指导未来其他神经保护药的研究有重要的借鉴意义。

目前一项II期临床试验ENACT-2（ClinicalTrials.gov. Indentifier：NCT02056574）将于2015年～2019年开展，计划入组300例颅内动脉瘤破裂继发蛛网膜下腔出血的患者，以验证NA-1在防治此类病人血管介入治疗后继发脑栓塞的有效性和安全性[18]。另一项III期临床试验Field Ran⁃domization of NA-1 Therapy in Early Responders（FRON⁃TIER）也将于2015年～2017年开展，计划入组558名急性脑缺血患者，在入院前卒中起病3 h内为患者注射NA-1，进一步评估NA-1的有效性和安全性[18]。这些临床试验结果值得期待。

NA-1临床研究的初步成功使PSD-95抑制剂受到广泛的关注，许多研究团队致力于开发新药物，提高其生物学效应。Tat-N-dimer是一种二聚体配体，将作用于PSD-95氨基端2个PDZ结构域的两种多肽连接，在体外细胞及小鼠中初步证实比单体NA-1有更强的亲和力和更长的半衰期[19]。由于肽类药物存在易被蛋白水解酶降解、给药途径受限、生产费用较高、可能存在免疫排斥等缺点，Zhou等[21]设计并合成出一种非肽类小分子药物ZL006，可破坏nNOs β-finger结构，干扰PSD-95与nNOs的结合，在离体细胞及小鼠中初步证实其具有神经保护作用。上述PSD-95新型抑制剂的有效性和安全性仍需更多临床前及临床研究结果的支持。

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R743(

2014-11-14）

A（责任编辑:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.06.014

* 中山大学附属第一医院神经内科（广州 510080）

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