RWD结构小泛素化增强子与缺氧诱导因子-1α在AtT-20细胞的表达☆

何伟杨炎林沈晓黎李敏张焱涂伟祝新根

·论 著·

RWD结构小泛素化增强子与缺氧诱导因子-1α在AtT-20细胞的表达☆

何伟*杨炎林*沈晓黎*李敏*张焱*涂伟*祝新根*

目的研究RWD结构小泛素化增强子（RWD containing sumoylation enhancer，RSUME）调控缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF-1α）对AtT-20细胞侵袭的影响。方法通过氯化钴模拟小鼠垂体腺瘤AtT-20细胞的缺氧环境，并应用实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测RSUME、HIF-1α的mRNA和蛋白水平的改变；然后运用HIF-1α小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）及阴性对照序列转染小鼠垂体腺瘤AtT-20细胞，实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测RSUME的mRNA和蛋白水平的改变；运用RSUME siRNA及阴性对照序列转染小鼠垂体腺瘤AtT-20细胞后，实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测HIF-1α的mRNA和蛋白水平的改变；并用Transwell及MTT法检测AtT-20细胞侵袭的改变。结果氯化钴作用AtT-20细胞后，细胞中RSUME的蛋白（P=0.003）和HIF-1α的蛋白（P=0.002）水平明显升高；HIF-1α siRNA转染的AtT-20细胞中RSUME mRNA（P=0.162）及蛋白（P=0.668）水平表达无明显变化；RSUME siRNA转染的AtT-20细胞中HIF-1α蛋白水平表达明显降低（P＜0.001），而mRNA水平未见明显改变（P=0.136）；RSUME siRNA转染组AtT-20细胞侵袭率较RSUME阴性对照组及空白对照组低(侵袭抑制率=26.2%±8.4%)。结论缺氧可诱导RSUME的表达，RSUME可调控HIF-1α的蛋白水平的作用影响AtT-20细胞的侵袭。

RWD结构小泛素化增强子 缺氧诱导因子1α AtT-20肿瘤侵袭

肿瘤快速生长往往伴随肿瘤血供的不足，易产生缺氧的微环境，而缺氧的微环境会加快肿瘤的生长速度，增加肿瘤的侵袭能力。缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF-1α）在肿瘤侵袭的过程中扮演着重要角色，HIF-1α可通过促进血管新生增加肿瘤侵袭性，然而HIF-1α在常氧环境下极易被降解。近期研究发现HIF-1α在肿瘤的稳定表达需依赖RWD结构小泛素化增强子（RWD containing sumoylation enhancer，RSUME）的调控[1]。侵袭性垂体腺瘤能对周围组织结构侵袭，其侵袭生长依赖HIF-1α稳定表达，因此RSUME在侵袭性垂体腺瘤中的作用至关重要。但RSUME在垂体腺瘤侵袭过程中扮演什么角色目前尚未报道。本研究通过小鼠垂体腺瘤AtT-20细胞为对象，通过体外建立缺氧模型，并应用HIF-1α、RSUME基因的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）转染，研究RSUME与HIF-1α在AtT-20细胞的表达，以及对肿瘤侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象AtT-20细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。细胞用含10%胎牛血清、5%青霉素-链霉素双抗的RPMI-1640培养基（美国Hy⁃clone公司）置于37℃、5%CO2培养箱中培养；2～3d传代1次，取对数生长期的细胞用于后续实验。试剂与仪器：Lipofectamine 2000购自Life生物有限公司；引物由上海生物工程公司合成；RIPA裂解液、总RNA抽提试剂Trizol、Taq PCR Mix，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔、山羊抗小鼠（二抗）、化学发光试剂盒购自武汉博士德生物工程公司；RSUME、HIF-1α基因序列的特异性小干扰RNA由上海吉玛公司设计合成；SYBR®Premix Ex Taq™Ⅱ购自Takara公司；RWDD3兔抗人、兔抗鼠多克隆抗体购自美国nvous公司，HIF-1α兔抗人、兔抗鼠多克隆抗体购自cell signaling生物有限公司；Transwell小室及Matrigel胶购自北京乐博生物科技有限公司。

1.2 氯化钴模拟肿瘤缺氧环境取生长良好的AtT-20细胞，移至15 mL离心管后充分吹打，置于低速离心机中1000r/min离心5 min，弃置上清液，加入适量培养液悬浮细胞。将悬浮细胞接种于培养瓶中培养，生长至融合度约60%时换液，加入含有100μmol/L氯化钴的培养液。培养过程中用倒置显微镜观察细胞生长状态。

1.3 RSUME siRNA和HIF-1α siRNA转染小鼠垂体腺瘤AtT-20细胞AtT-20细胞接种12孔细胞培养板中，1×105个/孔，细胞转染按照Lipo⁃fectamine 2000说明书进行。RSUME siRNA转染实验分：空白对照组、siRNA negative control（NC）组和RSUME siRNA转染组。HIF-1α siRNA转染实验分：空白对照组、siRNA negative control（NC）组和HIF-1α siRNA转染组。RSUME siRNA序列为5'GGACTTGTGGGTGAGGATG 3'，阴性对照序列为5'GGATGGGAC TGGTTGGATG 3'；HIF-1α siRNA序 列 为 5’CCAACCTCAGTGTGGGTAT 3’，HIF-1α siRNA阴性对照序列为5’CCAT⁃GTAG-GCGCAGTCTAT 3’由上海吉玛公司纯化合成。转染48h后荧光显微镜下观察含有红色荧光的AtT-20细胞数，若含荧光细胞比例占50%以上，用于行实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测。

1.4 qRT-PCR检测RSUME、HIF-1α的mRNA表达使用总RNA抽提试剂，提取上述AtT-20细胞总RNA，各组AtT-20细胞取1×106个；配制PCR反应液：2μL cDNA，上下游引物各1μL，SYBR®Premix Ex Taq™Ⅱ10μL，添加去离子水使总体积达到20μL。RSUME上游引物：5'GAGAGCGAG⁃GACTAAATATGTC 3'， 下 游 引 物 ：5' CATTTTCTCTTTGCATTTCTTTC 3'；HIF-1α上游引物：5'TACTGAGTTGATGGGTTATGA 3'，下游引物：5'AAGGCAGCTTGTATCCTC 3'；β-actin上游引物：5'GTGACGTTGACATCCGTAAAGA 3'；下游引物：5'GCCGGACTCATCGTACTCC 3'。进行Re⁃al Time PCR反应:95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s循环40次。根据公式ΔCt=Ct目的基因-Ctβ-actin和ΔΔCt=ΔCt处理组-ΔCt对照组统计结果，结果以2-ΔΔCt表示。

1.5 Western blot检测RSUME、HIF-1α蛋白的表达按照RIPA裂解液试剂盒说明书提取AtT-20的总蛋白，利用生物分光光度计比色分析总蛋白含量，取蛋白质40μg/孔进行电泳。80mV，在10%SDS-PAGE电泳2 h，蛋白胶条移至PVDF膜，250mA转膜80min。5%脱脂奶粉封闭液室温下封闭2 h，TBST洗膜3次。分别加入RWDD3、HIF-1α兔抗人多克隆抗体（1：1000稀释）、β-actin鼠抗人多克隆抗体(1∶5000稀释)一抗，4℃过夜孵育；洗膜3次后加入二抗(1∶5000稀释)。依据增强化学发光（Enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒操作说明进行显影、定影。利用凝胶图像分析系统对胶片进行灰度扫描和净光密度值分析。结果以目的蛋白/内参的IOD比值表示。

1.6 Transwell小室进行细胞侵袭试验将Tran⁃swell小室放入24孔板，50mg/L的Matrigel胶用无血清培养基1：8稀释，包被8μm孔径的Transwell上室的底部表面；用无血清的RPMI-1640培养基重悬细胞，调整细胞密度约1×105个/mL，各组取200μL加入上室，下室加10%胎牛血清培养液500μL，常规培养24 h（每组设3个重复小室）。AtT-20为悬浮细胞，直接迁移至下室培养基中。将下室培养基轻轻吹打混匀后行MTT法比较存活细胞数量。

1.7 MTT法检测垂体腺瘤AtT-20侵袭细胞数量将进行了Transwell侵袭试验的24孔板中加入500µL含0.5mg/mLMTT溶液，37℃孵育4h后加入500 µL DMSO，振荡10min，充分吹打混匀后加到96孔板中（每组设5个副孔），酶标仪检测490 nm波长处的吸光度值。结果以侵袭抑制率表示。侵袭抑制率（%）=（OD空白组-OD转染组）/OD空白组。

1.8 统计学方法各项试验重复3次，采用SPSS19.0进行分析，所有计量数据以均数±标准差表示，各组间数据的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK法，检测水准α=0.05。

2 结果

2.1 氯化钴模拟肿瘤缺氧环境能上调RSUME及HIF-1α的表达氯化钴缺氧处理小鼠垂体腺瘤AtT-20细胞后，提取细胞的总mRNA及蛋白，应用实时荧光定量PCR结果显示，RSUME mRNA表达水平明显升高（F=156.251，P＜0.001），而HIF-1α mRNA的表达水平无明显改变（F=1.050，P= 0.363）；运用蛋白质印迹法检测总蛋白，结果显示，RSUME蛋白的表达水平明显升高（F=44.351，P=0.003），HIF-1α蛋白的表达水平也明显升高（F=46.610，P=0.002）。见表1，图1。

2.2 HIF-1α siRNA转染对RSUME的表达无影响HIF-1α siRNA转染AtT-20细胞后，提取细胞的总mRNA及蛋白，运用实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测，结果行单因素方差分析及SNK法：与空白对照组及NC组相比，HIF-1α siRNA转染组的mRNA（F=471.476，P＜0.001）及蛋白水平明显下降（F=25.403，P＜0.001）；然而RSUME mRNA（F= 2.502，P=0.162）和蛋白（F=0.379，P=0.668）表达水平在三组之间均无明显变化。见图2，表2。

图1 各组AtT-20细胞中RSUME、HIF-1α的蛋白表达水平，1：空白对照组；2：CoCl2处理组

图2 HIF-1α siRNA转染后AtT-20细胞中RSUME、HIF-1α的蛋白表达水平，1：空白对照组；2：阴性对照组；3：siRNA转染组

表1 AtT-20细胞中RSUME、HIF-1α的mRNA及蛋白表达水平

表2 HIF-1α siRNA转染后垂体腺瘤AtT-20细胞中RSUME、HIF-1α mRNA和蛋白的表达

2.3 RSUME siRNA转染下调HIF-1α的蛋白表达RSUME siRNA转染AtT-20细胞后，提取细胞总mRNA及蛋白，运用实时荧光定量PCR检测，结果行单因素方差分析及SNK法：与空白对照组及NC组相比，RSUME siRNA转染组的mRNA水平明显下降（F=80.435，P＜0.001），HIF-1α mRNA的表达水平三组之间无明显变化（F=2.839，P=0.136）；蛋白质印迹法检测结果显示：与未转染对照组及NC组相比，RSUME siRNA转染组的蛋白水平明显下降（F= 63.929，P＜0.001），HIF-1α蛋白的表达水平也随着相应下降（F=96.345，P＜0.001）。见图3、表3。

2.4 RSUME siRNA转染后抑制垂体腺瘤AtT-20细胞的侵袭 Transwell侵袭实验后收集下室细胞，行MTT法检测侵袭细胞数量，测得OD值分别为：未转染对照组（0.395±0.049），siRNA阴性对照组（0.385±0.058），RSUME siRNA转染组0.293± 0.061。RSUME siRNA转染组对AtT-20细胞侵袭的抑制与空白对照组及NC组不全相等（F=67.023，P＜0.001），进一步行SNK法检验示，siRNA转染组的光密度值与空白对照组及NC组相比具有统计学意义，其侵袭抑制率（26.2%±8.4%）。

3 讨论

垂体腺瘤约占颅内肿瘤的10%～15%[2]，其侵袭能力是患者预后的主要因素。约有35%垂体腺瘤能对周围组织结构侵袭被定义为侵袭性垂体腺瘤[2]，目前垂体腺瘤的生长及侵袭的分子机制尚不清楚。关于垂体腺瘤的研究中，认为HIF-1的高表达为垂体腺瘤侵袭的重要因素。HIF-1是一种主要由分子量120kD的HIF-1α和分子量91～94 kD的HIF-1β两个亚基组成的异源性二聚体，其中HIF-1α是其主要的活性单位[3]。缺氧能诱导HIF-1α的表达，并且HIF-1α能通过调节多种基因的表达，参与肿瘤生成及侵袭的作用。众所周知，缺氧是肿瘤生长的基本特征，肿瘤的快速生长会导致肿瘤内部缺血缺氧，同时HIF-1α的表达也随之升高。本研究通过应用CoCl2模拟缺氧环境进行体外实验，结果显示缺氧可诱导HIF-1α的表达。随着肿瘤侵袭的增加，为保持肿瘤血供，肿瘤血管生存的能力将极大提高，而HIF-1α的靶因子血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)是该过程主要的调控因子[4]。然而正常氧浓度下HIF-1α很快会被细胞内的氧依赖性泛素蛋白酶结合，通过作用其泛素位点Lys391和Lys477，降解HIF-1α蛋白[5]。

图3 RSUME siRNA转染后AtT-20细胞中RSUME、HIF-1α的蛋白表达水平，1：空白对照组；2：阴性对照组；3：siRNA转染组

表3 RSUME siRNA转染后垂体腺瘤AtT-20细胞中RSUME、HIF-1α mRNA及蛋白的表达

小泛素化相关因子1（small ubiquitin related modifiers-1，SUMO-1）拥有与泛素分子相似的结构，能竞争性结合HIF-1α泛素化位点，竞争性抑制泛素化阻断蛋白质的泛素化-蛋白酶体降解途径，增加HIF-1α的稳定性[6]。SUMO化及作用首先需被E1激活酶激活，再转至E2结合酶，通过E3连接酶使SUMO羧基末端与HIF-1α的Lys残基通过异肽链连接，从而使HIF-1α SUMO化，稳定HIF-1α的作用[7]。但是SUMO化所需底物大部分都在细胞核内，RSUME可表达与SUMO的E2结合酶结构相似的结构蛋白，帮助SUMO-1与HIF-1α的泛素化位点结合，形成底物的SUMO化[8]，而缺氧诱导能进一步诱导SUMO化的作用，由此可见缺氧为垂体腺瘤侵袭的重要因素之一。因此我们在此推测缺氧是否为RSUME的诱导因素？本研究通过模拟体外缺氧环境，结果显示RSUME mRNA及蛋白的表达水平明显升高，证实缺氧为RSUME的诱导因素之一。

同时缺氧调控HIF-1α激活的分子机制中，部分学者认为HIF-1α在转录后进行调控[9]，部分学者认为HIF-1α在转录时进行调控[10]。在氯化钴模拟体外缺氧环境的实验中，我们发现：缺氧环境状态下的HIF-1α mRNA表达水平相对稳定，而蛋白水平却明显升高，这个结果与Kuiper学者的实验结果一致，证明缺氧调控HIF-1α发生在转录后。然而RSUME和HIF-1α之间的相互作用机制尚不清楚。

为了阐明垂体腺瘤中RSUME对HIF-1α的调控作用，本研究继续通过运用siRNA下调RSUME和HIF-1α的表达，结果显示通过抑制HIF-1α的表达，RSUME无论在mRNA的表达水平，还是在蛋白的表达水平上均未见明显改变。但当运用siRNA抑制RSUME表达，HIF-1α的mRNA表达水平无明显改变，但HIF-1α蛋白的表达水平明显下降。由此可见，RSUME可调节HIF-1α的表达影响垂体腺瘤的生长及侵袭，同时进一步证明RSUME在垂体腺瘤中对HIF-1α蛋白表达的影响主要发生在转录后。

RSUME最先由Carbia-Nagashima等[11]发现，并在小脑、垂体、心、肾、肝、胃、胰腺、前列腺和脾中检测出有较高的表达。Carbia-Nagashima等[14]曾提出，RSUME可成为肿瘤治疗新的靶点，但未进行相关研究。本研究通过siRNA抑制RSUME的表达，检测垂体腺瘤细胞的侵袭能力，结果显示：RSUME siRNA转染的AtT-20细胞的侵袭能力有所抑制，侵袭抑制率（%）=26.2%±8.4%。

垂体腺瘤的侵袭受多方面因素的影响，缺氧导致新生血管的形成为垂体腺瘤侵袭的主要因素，而HIF-1α在此过程尤其重要。然而HIF-1α仅仅为肿瘤侵袭过程中重要因素之一，因此垂体腺瘤的基因治疗需要进一步了解其作用机制，本研究证明RSUME可通过稳定HIF-1α的表达，进一步促进垂体腺瘤血管新生，影响肿瘤侵袭性。

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A

2015-01-25）

（责任编辑:甘章平）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.06.009

☆ 江西省自然科学基金（20142BAB205032）；江西省教育厅科学基金（编号：GJJ14064）；江西省科技厅科技支撑计划（编号：20133BBG70072）；国家自然科学基金（编号：30760258）

* 南昌大学第二附属医院神经外科（南昌330006）