崔永亮 蒋军广 谭伟丽 安金路 宋卫卫 郭世放
(郑州大学第一附属医院河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室,河南 郑州 450052)
凋亡相关基因caspase-8在非小细胞肺癌中的表达及临床意义
崔永亮 蒋军广 谭伟丽 安金路 宋卫卫 郭世放
(郑州大学第一附属医院河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室,河南 郑州 450052)
目的 探讨半胱天冬酶(caspase)-8在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及临床意义。方法 免疫组织化学法(S-P法)检测caspase-8在NSCLC(50例)及正常肺组织(20例)中的表达,TUNEL法检测凋亡细胞并计算凋亡指数(AI)。结果 有淋巴结转移者阳性率较无淋巴结转移者高(χ2=5.773,P=0.016)。TNMⅢ期和Ⅳ期者阳性率要高于Ⅰ期和Ⅱ期(χ2=6.417,P=0.011)。caspase-8与细胞凋亡指数呈正相关(r=0.885,P=0.000)。结论 caspase-8与NSCLC的发展关系密切,caspase-8阳性表达可能预测淋巴结转移。
caspase-8;肺肿瘤;细胞凋亡;免疫组织化学
非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的80% ~85%,其中60%~80%的肺癌患者在诊断时已属晚期,治疗多采用以化疗为主的综合治疗〔1〕。肿瘤的发生与基因密切相关,肿瘤发生的关键是基因突变或表达异常。细胞凋亡在肺癌中的作用已有较多研究,但是凋亡基因caspase-8在NSCLC中的表达及在细胞凋亡中的作用研究尚少。本文旨在探讨caspase-8在NSCLC中的表达及其与细胞凋亡的关系。
1.1 对象 随机选取我院病理科2010~2012年经胸外科切除的NSCLC标本50例,年龄44~77岁,手术前均未接受放化疗及其他治疗且病理诊断明确。按照美国联合癌症分类委员会和国际抗癌联盟制定的TNM分期标准进行分期〔2〕。其中男33例,女17例;年龄≥60者28例,年龄<60岁22例;鳞癌27例,腺癌23例;高分化9例,中分化26例,低分化15例;淋巴结转移者24例,无淋巴结转移者26例;TNM分期Ⅰ期加Ⅱ期共31例,Ⅲ期加Ⅳ期共19例;吸烟23例,不吸烟27例;肿瘤直径>3 cm者32例,≤3 cm者18例;肿瘤位于左侧20例,右侧30例;有胸腔积液者9例,无胸腔积液者41例。另选取20例距
所有病理标本均被蜡块包埋,由病理科专业人员切片,切完后随即放入60℃恒温烤箱内烘烤4 h,以防实验过程中反复冲洗标本导致切片脱离载玻片。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂 Rabbit Anti-caspase-8、罗氏TUNEL凋亡检测试剂盒、免疫组化染色试剂盒来自北京博奥森生物技术有限公司;浓缩型DAB试剂盒来自北京中杉生物工程公司。
1.2.2 S-P法染色 50例NSCLC组织及20例正常肺组织切片放入60℃恒温烤箱里30 min;梯度酒精脱蜡、水化;磷酸盐缓冲液(PBS)抗原修复;3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性;非免疫性动物血清阻断非特异性反应;滴加一抗,放入4℃冰箱过夜;第2天滴加生物素化标记的二抗;滴加辣根酶标记链霉卵白素;DAB显色;苏木素复染;梯度酒精脱水;中性树胶封片。
1.2.3 TUNEL法 烤片、脱蜡、脱水;Proteinase K工作液处理癌组织切片;TUNEL反应混合液处理肺癌组织;滴加converter-POD;DAB显色;苏木素复染;梯度酒精脱水;中性树胶封片。
1.2.4 阳性结果判断 免疫组化结果判定:caspase-8在NSCLC细胞质和(或)细胞核出现棕黄色颗粒。从两方面进行判断,①阳性染色程度:无染色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。②染色细胞百分率,高倍镜(400倍)下每个视野计数100个细胞,每张切片随机挑选10个视野,计算阳性细胞数占总癌细胞数百分比,<10%为0分,10% ~25%为1分,26% ~50%为2分,≥51%为3分。两个定量数字相加,总分值<4为阴性,≥4为阳性。细胞凋亡阳性结果判定:利用TUNEL法,肿瘤细胞核被染为棕黄色,用光学显微镜,计数每1 000个肿瘤细胞中凋亡细胞的个数并进行统计学分析。需排除严重的炎症反应和坏死灶,
避免造成假阳性结果〔3〕。凋亡细胞指数(AI)=凋亡细胞数/计数总细胞数。
1.3 统计学处理 应用SPSS17.0软件进行χ2检验、直线相关性分析。
2.1 caspase-8在NSCLC组织中的表达 细胞核和(或)细胞质中经免疫组织化学法染成棕黄色,肺癌组织阳性率为62.0%(31/50),正常肺组织阳性率为65%(13/20),两者差异无统计学意义(χ2=0.055,P=0.814)。有淋巴结转移者与无淋巴结转移者阳性率高,差异显著(χ2=5.773,P=0.016)。TNM Ⅲ期和Ⅳ期阳性率高于Ⅰ期和Ⅱ期(χ2=6.417,P=0.011)。caspase-8的表达与性别、年龄、病理分型、高中低分化、吸烟、肿瘤大小、肿瘤位置、胸腔积液无明显关系(P>0.05),见表1。
表1 caspase-8的表达与NSCLC临床病理特征关系〔n(%)〕
2.2 caspase-8与细胞凋亡 利用直线相关分析表明,caspase-8与细胞凋亡呈正相关(r=0.885,P=0.000)。其中0分AI值3.60±0.58 ,1~2分为5.83±0.34,3~4分为7.64±1.46,5~6分为10.98±1.67。
近年来,caspase家族的异常与肿瘤的发生成为研究的热点,Poulaki等〔4〕研究表明,caspase-8表达缺失或低表达导致肿瘤细胞对凋亡刺激敏感性降低,可能参与肿瘤的发生发展,NSCLC患者修复此基因可能对治疗有益。
宗振峰等〔5〕发现肺癌组织中为64.7%,正常肺组织中caspase-8的阳性率为73.5%,无明显差异,但对于癌组织中的caspase-8蛋白的表达强度和定位要明显的高于正常组织的表达。潘峥等〔6〕利用免疫组织化学探讨 caspase-8在人乳腺癌组织中的表达及相关性,caspase-8表达的阳性率显著低于相应的癌旁组织。本实验结果与宗振峰等〔5〕报道结果一致。杜宁等〔7〕利用免疫组织化学、RNA干扰技术来探索 caspase-8在NSCLC A549细胞中表达,发现caspase-8在淋巴结转移中有高表达,没有表达caspase-8的NSCLC A549细胞入侵和转移能力较低。宗振峰等〔5〕研究表明NSCLC组织中caspase-8蛋白表达与淋巴结转移有关。本研究结果提示caspase-8在NSCLC淋巴转移过程中有重有作用,caspase-8的表达下调与缺失与肿瘤的淋巴结转移有一定关系。宗振峰〔5〕、杜宁等〔7〕表明,NSCLC 中caspase-8蛋白表达与TNM分期有关。与本实验TNM分期结果一致,提示caspase-8的下调预示患者预后差。潘峥等〔6〕发现caspase-8表达与高中低分化、肿瘤大小密切相关。沈俊俊等〔8〕利用 RT-PCR 和免疫组化方法检测 NF-κB、caspase-8 mRNA和蛋白表达,胃癌组织中的caspase-8蛋白表达仅与肿瘤分化程度有关,NF-κB蛋白表达与肿瘤分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移有关。NF-κB通路活化可能通过下调caspase-8表达发挥抗凋亡效应。而本实验中高、中、低分化差异无统计学意义。产生分歧的原因可能与样本量、试验方法等不一致有关。另外基因下调或缺失导致凋亡减少,与肿瘤的发生、发展密切相关。
1 翟展艺,蒋军广,翟建霞,等.PTEN、MRP在非小细胞肺癌组织中的表达及生物学意义〔J〕.中国老年学杂志,2011;31(10):1732-3.
2 郑元元,蒋军广,赵 娜,等.γ-synuclein在非小细胞肺癌中的表达〔J〕.中国老年学志,2011;31(24):4771-3.
3 刘瑞芬,蒋军广,张晓燕,等.凋亡相关基因bax在非小细胞肺癌中的表达及临床意义〔J〕.中国老年学杂志,2013;33(9):2002-3.
4 Poulaki V,Mitsiases CS,Mcmullan C,et al.Human retinoblastoma cells are resistant to apoptosis induced by death receptors:role of caspase-8 gene silence〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci,2005;46(1):358-66.
5 宗振峰,哀 君,杨 博,等.非小细胞肺癌中caspase-8的表达及意义分析〔J〕.中国医药导刊,2013;15(5):761-4.
6 潘 峥,陈 军,覃冠德,等.c-FLIP及caspase-8表达在乳腺癌组织中的表达及临床意义〔J〕.实用癌症杂志,2012;27(3):244-6.
7 杜 宁,孙向飞,胡丽娟,等.Caspase-8在非小细胞肺癌中的表达及其在肺癌A549细胞侵袭转移中作用〔J〕.细胞与分子免疫学杂志,2012;23(6):835-83.
8 沈俊俊,韩 虹,李 静,等.NF-κB、caspase-8在胃癌中的表达和临床意义〔J〕.胃肠病学,2012;17(4):226-9.
R734.2
A
1005-9202(2015)09-2431-02;
10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.055
河南省科技攻关重点项目(102102310133)
蒋军广(1963-),男,硕士生导师,主任医师,教授,主要从事呼吸疾病的基础与临床研究。
崔永亮(1988-),男,在读硕士,主要从事呼吸疾病的基础与临床研究。NSCLC组织旁3 cm以上正常组织(病理证实)为对照组。
〔2013-07-11修回〕
(编辑 李相军/滕欣航)