小动物超声机在动脉粥样硬化模型中的评价作用

陈燕芬 卢 军 张敏州 王 磊 (广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 500)

小动物超声机在动脉粥样硬化模型中的评价作用

陈燕芬 卢 军1张敏州2王 磊2(广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510120)

目的 探讨一种简单快速评价ApoE－/－小鼠动脉粥样硬化模型成功建立与否的方法。方法 18只ApoE－/－小鼠随机分为模型组(10只)和对照组(8只)。模型组采用高脂饲料喂养16 w建立动脉粥样硬化模型，对照组予普通饲料喂养。造模16 w后，用Vevo2100小动物超声机MS-550D探头观测ApoE－/－小鼠双侧颈动脉斑块形成情况;并检测甘油三酯(TG)、血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平，HE染色检测颈动脉及主动脉病理形态学的变化。结果 与对照组相比，模型组小鼠体重较快明显增加，颈动脉小动物超声可见明显的斑块影，LDL-C及TC水平升高(P＜0.05，P＜0.01)，小鼠内膜、中膜增厚，颈动脉斑块形成。结论 小动物超声可简单快速评价动脉粥样硬化小鼠模型建立成功与否。

小动物超声;动脉粥样硬化

动脉粥样硬化(AS)发病机制复杂，涉及血管内皮细胞损伤、平滑肌细胞和胶原增殖、泡沫细胞形成、血小板黏附聚集、脂质代谢障碍等方面〔1〕，可引起冠心病和脑梗死等，是严重危害人类健康的疾病之一。目前有多种建立动脉粥样硬化动物模型的方法，而评价是否成功建模的方法大部分是做病理形态学检查，但病理形态学检查不能动态观察斑块，很难通过活体检查确定是否已成功建立可靠的AS模型。小动物超声既是无创技术，又可动态观察动脉的变化。故本研究探讨采用Vevo2100小动物超声机评价ApoE－/－小鼠活体的颈动脉斑块形成情况。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性基因敲除 ApoE－/－小鼠，8周龄，体重(20±2)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。高脂饲料〔2〕(1.25%胆固醇，15%脂肪，0.5%胆酸)购自广东省医学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 分组 将ApoE－/－小鼠随机分为对照组8只(饲养1 w后死亡1只)，予普通饲料喂养;模型组10只，予高脂饲料喂养，均16 w。

1.2.2 Vevo2100小动物超声机检查ApoE－/－小鼠双侧颈动脉斑块的形成 ApoE－/－小鼠经三溴乙醇腹腔注射麻醉后脱毛，在小鼠板上的心电图金属电极上涂导电膏，并将小鼠仰卧式置于小鼠板中央，用3M透明胶将小鼠的四肢紧贴于四个电极金属片，于颈部涂上耦合剂，选用MS-550D探头及B超模式，探头方向为90°，对准正中的气管位置，缓慢移动探头到小鼠颈部，直到获得清晰图像，以气管强回声光影为标志，微调探头方向，向左微移动，即可获得左颈动脉的图像，以颈动脉分叉为标志，若颈动脉内壁见密度稍高的强回声影即为形成的斑块，再向右微移动，即可获得右颈动脉的图像，也以颈动脉分叉为标志。

1.2.3 标本收集 待饲养0、4、8、12、16 w之后，分别将小鼠称重，16 w后麻醉并经心脏取血处死，4℃冰箱1 h，以3 000 r/min离心10 min，取上清液，放入－80℃冰箱备用。手术分离并取下双侧颈动脉及主动脉，用PBS冲洗，置于4%多聚甲醛溶液中室温保存备用。

1.2.4 生化指标检测 血清样本用生化分析仪检测甘油三酯(TG)、血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。

1.2.5 病理学检测 将固定后的颈动脉及主动脉取出，梯度酒精脱水、石蜡包埋后切片，行HE常规染色。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件，计量资料用±s表示，组间比较采用Dunnett t检验，两两比较采用SNK-q检验。

2 结果

2.1 两组体重变化 两组小鼠0 w体重无明显差异(P=0.396);与0 w相比，模型组小鼠从第4周体重开始增加明显(P＜0.05)，对照组小鼠从第8周体重开始增加明显(P＜0.05);第16周时，两组体重相比亦无明显差异(P=0.201)(表1)。

2.2 生化指标的变化 与对照组相比，模型组LDL-C及TC水平升高(P＜0.05)，HDL-C及TG水平无统计学差异(P＞0.05)(表 2)。

表1 第0、4、8、12、16周两组小鼠体重变化(g，±s)

表1 第0、4、8、12、16周两组小鼠体重变化(g，±s)

与0 w 比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01

0 w 4 w 8 w 12 w 16 w模型组 10 24.40±3.13 27.20±2.661) 29.40±2.672) 30.70±2.712) 30.90±2.332)组别 n对照组 7 25.71±2.93 28.86±3.48 30.57±2.942) 31.29±2.292) 32.29±1.702)

2.3 Vevo2100小动物超声机评价结果 模型组可观察到19处有斑块的影像，斑块面积为(0.335 6±0.020 9)mm2，斑块面积之和达3.36 mm2;而对照组只观察到1处有斑块的影像，斑块面积仅为0.06 mm2(见图1)。

2.4 病理形态学的变化 对照组小鼠主动脉内膜光滑平整，管壁呈半透明状，无脂纹和斑块形成，弹力板完整。模型组小鼠主动脉斑块形成，泡沫细胞大量存在，淋巴细胞广泛浸润，内膜、中膜增厚，血管腔明显狭窄。见图2。

表2 喂养16 w后两组小鼠血脂水平比较(mmol/L，±s)

表2 喂养16 w后两组小鼠血脂水平比较(mmol/L，±s)

与对照组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01

组别 n HDL-C LDL-C TC TG模型组 10 0.69±0.45 3.41±0.522)10.39±1.841)1.14±0.44对照组7 1.39±1.04 1.34±0.44 8.54±1.23 0.80±0.40

图1 两组ApoE－/－小鼠AS超声影像图比较

图2 ApoE－/－小鼠主动脉血管HE染色

3 讨论

AS是一种慢性炎症性血管病，全身的大、中、小动脉均可发病，发展到一定阶段可继发多种疾病。因此，AS发病机制的研究受到广泛关注，而动物模型对研究AS和易损斑块的发生机制和病理生理、检测相关诊断方法的有效性和实用性、评价抗AS和防治冠心病药物的疗效是一种不可缺少的研究工具。随着转基因技术和基因敲除技术的出现，目前已成功培育出脂蛋白代谢基因缺陷鼠，使得鼠模型在AS模型的研究中重新受到重视。虽然使用这类基因敲除鼠容易制作成功AS斑块的动物模型，但是评价是否成功建立可靠的AS动物模型的方法大部分是做病理形态学的检查，但病理形态学的检查不能实现动态观察，必须处死动物取相应的组织才能进行检查，故不能确保是否已成功建立可靠的AS模型，使得实验周期延长甚至失败，付出更高的实验成本。

小动物超声技术目前主要运用于心肌肥厚、心衰及心肌梗死等动物实验研究，不仅可以测量颈动脉内中膜厚度，还可以测不同部位的平均血流速度及相对壁剪切应力，如升主动脉、主动脉弓及降主动脉，甚至还能运用超声指导小动物大动脉损伤模型的造模〔2，3〕，但是国内鲜少有这方面的报道。

笔者运用小动物超声技术，选择最新型号的Vevo2100小动物超声机，使用超高分辨率的MS-550D血管探头，动态观察小鼠的颈动脉情况，直至观察到颈动脉的内中膜增厚，甚至可明确见到密度稍高的斑块影。病理形态学检查结果也证明模型组造模成功。颈动脉是全身动脉的窗口，故用小动物超声评价颈动脉血管斑块形成的情况，可大大增加AS模型的成功率。

综上，小动物超声是一种简单快速评价AS小鼠模型成功建立与否的诊断方法，并且能够动态观察，方便快捷，准确性高，值得在AS等动物实验研究中推广。

1 LUSIS AJ.Atherosclerosis〔J〕.Nature，2000;407(6801):233-41.

2 Tomita H，Hagaman J，Friedman MH，et al.Relationship between hemodynamics and atherosclerosis in aortic arches of apolipoprotein E-null mice on 129S6/SvEvTac and C57BL/6J genetic backgrounds〔J〕.Atherosclerosis，2012;220(1):78-85.

3 Meng X，Zhang F，Valji K，et al.Ultrasound guidance for the creation of a small animal model of aortic injury〔J〕.J Vasc Interv Radiol，2011;22(8):1193-7.

Evaluation of animal ultrasound imaging in the atherosclerosis model

CHEN Yan-Fen，LU Jun，ZHANG Min-Zhou，et al.
The Second Clinical Medical College，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510120，Guangdong，China

ObjectiveTo investigate a simple and fast method for evaluating an atherosclerosis model in ApoE－/－mice，particularly with carotid atherosclerotic plaque.MethodsEighteen ApoE－/－mice were divided into two groups.The model group was fed with high fat food for 16 weeks.8 mice were fed with chow food for 16 weeks as the sham.On the 0，4th，8th，12th，16thweek after fed，the body weight was detected.The carotid artery of ApoE－/－mice was imaged with the vevo2100 animal ultrasound by MS-550D probe.On the 16th week，the levels of triglyceride(TG)，total cholesterol(TC)，low-density lipoprotein(LDL)and high-density lipoprotein(HDL)were detected.The pathological morphology of carotid artery or aorta was determined by HE staining.ResultsCompared with those of the sham，the levels of LDL and TC were increased(P＜0.05，P＜0.01)，more plaques of carotid artery were detected with the animal ultrasound imaging，carotid intima and tunica media were thickened and carotid plaque was significantly formed in model group.ConclusionsAnimal ultrasound imaging technique could be a simple and fast method to evaluate if the atherosclerosis animal model is established successfully or not.

Animal ultrasound imaging;Atherosclerosis

R743

A

1005-9202(2015)09-2310-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.003

国家自然科学基金项目(81202782);广东省中医院拔尖人才专项(2014KT1477)

1 广州中医药大学第一临床医学院 2 广东省中医院重症医学科

王 磊(1980-)，男，副主任医师，博士，硕士生导师，主要从事冠心病的中西医结合治疗研究。

陈燕芬(1985-)，女，博士，主要从事重症心血管疾病中西医结合临床与实验研究。

〔2014-12-25修回〕

(编辑 徐 杰)