BJO对EC109细胞增殖和凋亡作用的研究

罗卫民 郭家龙 刘华 刘斌 罗湘玉 罗玲 张军

442000湖北省十堰市太和医院胸心大血管外科1

430000武汉华中科技大学同济医学院神经内科2

BJO对EC109细胞增殖和凋亡作用的研究

罗卫民1郭家龙1刘华1刘斌2罗湘玉1罗玲1张军1

442000湖北省十堰市太和医院胸心大血管外科1

430000武汉华中科技大学同济医学院神经内科2

目的：探讨不同浓度的鸦胆子油乳对食管癌EC109细胞增殖和凋亡的作用。方法：利用MTT法检测食管癌EC109细胞增殖，应用流式细胞术和Hoechest33342法测细胞凋亡。结果：鸦胆子油乳对管癌EC109细胞增殖和凋亡具有作用并且具有剂量依赖性作用。结论：鸦胆子可通过对细胞的形态，对细胞周期、对凋亡基因及细胞免疫功能的影响来抑制肿瘤细胞的增殖。

鸦胆子油乳；食管癌细胞；细胞增殖和凋亡

鸦胆子油乳在临床中被应用于多种恶性肿瘤的辅助治疗，但在食管癌中的作用机制尚未明确。本文研究鸦胆子油乳对食管癌细胞作用的机制，为该药在食管癌治疗中的应用提供证据。

资料与方法

传代培养食管癌EC109细胞。

实验分组：将生长良好的细胞分为正常细胞对照组和A、B、C 3个试验组，试验组中分别加入药物浓度为5 μg/ mL、10 μg/mL、20 μg/mL的鸦胆子油乳，继续培养48 h。

MTT法检测EC9706细胞增殖：①MTT溶液配置：称取250 mg MTT，加50 mL PBS，在电磁力搅拌机上搅拌30 min，用直径0.22 μm的微孔过滤器除菌，分装，4℃保存，2周内使用。②取对数期生长的EC109细胞1瓶，PBS洗涤2次，0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，计数，接种4×103/孔浓度的细胞150 μL于96孔培养板，共种3块培养板。置5%CO2，饱和湿度37℃温箱中继续培养。③EC109细胞培养16 h后更换培养基，每孔加入180 μL DMEM培养液，按不同分组进行细胞转染后，继续置5% CO2，饱和湿度37℃温箱中继续培养。④各组EC109细胞培养24 h、48 h及72 h后，每孔加20 μL MTT(5 mg/mL)温箱内继续孵育。4 h后，小心吸弃孔内液体，加150 μL二甲基亚砜溶解沉淀，振荡l0 min，溶解结晶物。⑤比色：选择570 nm波长，空白对照调零，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值(A值)，记录结果，描绘MTT增殖曲线。

流式细胞术检测EC9706细胞凋亡：①在细胞转染72 h后，分别收集6孔板中分组培养的细胞的细胞培养液，之后常规消化细胞。细胞消化下来后，分别加入上步骤中所收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1 000 g离心5 min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。②取5～10万重悬的细胞，1 000 g离心5 min，弃上清，加入195 μL Annexin V-FITC结合液(1X)轻轻重悬细胞。③加入 5 μ L Annexin V-FITC，轻轻混匀。④20～25℃避光孵育10 min。⑤1 000 g离心5 min，弃上清，加入190 μL Annexin V-FITC结合液(1X)轻轻重悬细胞。⑥加入10 μL碘化丙啶(PI)染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。⑦随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

Hoechest33342法测凋亡：①取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡至少5 min，无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS洗涤3遍，再用细胞培养液洗涤1遍。将盖玻片置于6孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%～80%满。②按不同分组进行细胞转染后，吸尽培养液，加入固定液，固定10 min。③去固定液，用PBS洗两遍，吸尽液体。④加入终浓度10 μg/mL的Hoechst33342染色液，染色5 min。手动晃动数次。⑤用PBS洗2遍。⑥将贴有细胞的盖玻片盖于载玻片上，尽量避免气泡。⑦荧光显微镜检测。

结果

鸦胆子油乳对管癌EC109细胞增殖和凋亡具有作用。不同浓度的鸦胆子油乳具有剂量依赖性作用。

讨论

鸦胆子对肿瘤细胞的作用：①鸦胆子对细胞形态的影响：鸦胆子可以使细胞变圆，胞浆浓缩，细胞内出现大小不等的空泡，泡内容物电子密度与基质相似，细胞核不规则，染色质边集浓缩，呈断裂状，部分线粒体肿胀、空泡化，可见凋亡小体形成。②鸦胆子对细胞周期的影响：鸦胆子油乳对癌细胞G0、G1、S、G2、M期有杀伤和抑制作用，能明显抑制肿瘤细胞DNA的合成，该药能直接进入癌细胞，通过影响质膜系统和线粒体，使之变性坏死。③鸦胆子对bcl-2基因的影响：bax功能与bcl-2截然相反，是促进细胞死亡的基因，两者在细胞中常协同表达，形成同源二聚体，按其比值共同调控着细胞的凋亡过程。研究发现，经鸦胆子油乳作用后p53和Bcl-2在肝癌细胞中的表达均下降。

鸦胆子对细胞免疫功能的影响：鸦胆子油乳注射液用于晚期肺癌的化疗组外周CD3+、CD4+、CD8+、CD5+明显升高。说明鸦胆子油乳注射液联合化疗比单用化疗能明显提高机体免疫功能，且可减少化疗不良反应。

综上所述，鸦胆子可通过对细胞的形态，对细胞周期、对凋亡基因及细胞免疫功能的影响来抑制肿瘤细胞的增值。

[1]李英,徐功立,李颖,等.鸦胆子油乳诱导白血病U937细胞凋亡的实验研究[J].中华血液学杂志,2004,25(6):381.

[2]刘悦王,禾符,庚庆吉,等.鸦胆子油乳对膀胱癌影响的实验研究[J].中华泌尿外科杂志,2001,22(6):336-338.

[3]韩宇,杨承汉.食管癌中nm-32H1基因突变与癌转移的关系[J].新乡医学院学报,2001, 18(4):238-239.

Research of BJO on EC109 cell proliferation and apoptosis

Luo Weimin1,Guo Jialong1,Liu Hua1,Liu Bin2,Luo Xiangyu1,Luo Ling1,Zhang Jun1
Department of Chest Big Vascular Surgery,Taihe Hospital,Shiyan City,Hubei Province 4420001
Department of Internal Medicine-Neurology,Wuhan Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology 4300002

Objective:To investigate the effect of Brucea javanica oil emulsion with different concentrations on the proliferation and apoptosis of esophageal cancer EC109 cells.Methods:We detected the proliferation of esophageal cancer cell line EC109 by used the MTT method,measured the cell apoptosis by flow cytometry and Hoechest33342 method.Results:Brucea javanica oil emulsion had the effect on proliferation and apoptosis of cancer cells EC109 tube and has a dose dependent effect.Conclusion: Brucea Javanica can through the effect of cell morphology,cell cycle,apoptosis gene and cell immune function to inhibit the proliferation of tumor cells.

Brucea javanica oil emulsion;Esophageal cancer cells;Cell proliferation and apoptosis

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.7.2