基因修饰内皮祖细胞在冠心病治疗中的研究进展

马国栋 梁伟钧（通讯作者）524000广东医学院附属医院心血管内科

基因修饰内皮祖细胞在冠心病治疗中的研究进展

马国栋 梁伟钧（通讯作者）
524000广东医学院附属医院心血管内科

冠心病的发病机制复杂，其中一个重要的发病机制是冠状动脉内皮损伤和修复两者间的平衡受到破坏。目前关于冠心病治疗方法主要包括药物治疗、冠脉搭桥、支架介入等。内皮祖细胞在一定条件下能分化为内皮细胞，参与血管新生。但是内皮祖细胞在人体组织中含量极低，远不够为移植治疗所用。另外，有多项研究显示，年龄大、冠心病、糖尿病、高血压患者的内皮祖细胞相比正常者量更少，且其功能显著下降。近年有许多学者提出通过基因修饰的内皮祖细胞能解决上述问题。下面笔者为基因修饰内皮祖细胞移植治疗的研究予以综述，为临床治疗冠心病提供新思路。

冠心病；内皮祖细胞；基因修饰

冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary atherosclerotic heart disease）又称冠心病，是指冠状动脉粥样硬化使管腔狭窄或阻塞导致心肌缺血缺氧而引起的心脏病，其中一个重要的发病机制是冠脉内皮损伤和修复两者间的平衡受到破坏。目前关于冠心病治疗方法主要包括药物治疗、冠脉搭桥、支架介入等，这些方法虽可使闭塞的血管再通，但并不能挽救微小血管的损害，同时还有心肌缺血再灌注损伤的风险。这迫使人们去寻找一个更好的方法来治疗冠心病。内皮祖细胞是成体干细胞中的一种，在一定条件下能分化为内皮细胞，参与血管新生。但是内皮祖细胞在人体组织中含量极低，远不够为移植治疗所用。另外，有多项研究显示，年纪大、冠心病、糖尿病、高血压患者的内皮祖细胞相比正常人数量更少，而且其功能显著下降。近年有许多学者提出通过基因修饰的内皮祖细胞能解决上述问题。下面笔者为基因修饰内皮祖细胞移植治疗的研究予以综述，为临床治疗冠心病提供新思路。

内皮祖细胞概要

内皮祖细胞（Endothelial progenitor cell，EPCs），是成体干细胞中的一种，在一定条件下可分化为内皮细胞且具有内皮细胞功能。1997年，Asahara等首次证明了外周血中存在能在体外增殖、迁移并分化为内皮细胞的EPCs[1]。随着对EPCs进一步研究证实，它主要来源于骨髓与脐带血中，而外周血中只有极少量分布。2004年，Hur等发现人外周血中存在两种不同类型的EPCs，即早期EPCs和晚期EPCs[2]。早期EPCs是指在体外培养3～5d后出现的梭形细胞，主要参与机体血液系统的发育及炎性免疫应答，而没有形成血管的功能；EPCs是指体外培养2周后出现的铺路石样细胞，它具有细胞增殖、迁移、粘连及在基底膜基质上形成血管的能力。因其EPCs不具备内皮细胞的功能，且不具有增殖能力，不能传代培养，所以早期EPCs不是真正意义上的EPCs。而晚期EPCs能分化为内皮细胞且具有内皮细胞的功能，是真正意义的EPCs。

内皮祖细胞的鉴定

目前国际上比较认可的是采用免疫细胞法与双荧光染色法的共同鉴定EPCs。免疫细胞法主要有两种，一种是免疫磁珠法，另一种是流式细胞分选法。这两种方法各有优劣，但共同点都是通过检测细胞表面的特有抗原标记物，如KDR+、CD133+、CD34+等。虽然以上细胞表面标志物为鉴定EPCs的经典标记物，但是这些标记物并不具有特异性。KDR主要存在于分化成熟且参与血管新生的内皮细胞表面，同时它在来源于内胚层的肝祖细胞的表面也有表达。而CD34主要表达于骨髓来源的造血干细胞表面，其在介导细胞间黏附作用中起到重要作用。CD133是造血干细胞的表面标记物，它能表达于人脐带血来源CD34-造血干细胞的表面。同时它还能在EPCs表面表达，但不能表达于成熟的内皮细胞表面。故一般用同时表达KDR+、CD133+、CD34+这三种特有标记物来共同鉴定EPCs。双荧光染色法是应用EPCs具有吞噬DiI-Ac-LDL，结合FITC-UEA-1的特性，通过荧光显微镜观察到，EPCs吞噬DiI-Ac-LDL而在细胞浆中呈现红色荧光，EPCs结合FITC-UEA-1而在细胞膜上呈现绿色荧光[3]。

内皮祖细胞与血管新生

血管新生（angiogenesis）是指在机体中内皮祖细胞迁移、增殖、管腔形成并发展成一个有血流供应系统的过程。多项研究表明，EPCs的增殖、动员、募集在血管新生机制中起到至关重要的作用。有研究表明当机体血管受损、组织缺血缺氧时，骨髓EPCs会动员到外周血中，通过定向靶位作用迁移到缺血区域，参与血管新生[4]。虽然这其中机制尚未明确，但多位学者研究表明，EPC相关细胞因子如血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子、碱性成纤维生长因子在其中发挥着重要作用。

EPCs移植治疗局限性与新思路

虽然上述移植EPCs治疗冠心病已经被多项研究支持其可行性，但是EPCs在人体组织中含量极低，远不够为移植治疗所用。另外有多项研究显示，年纪大、冠心病、糖尿病、高血压患者的内皮祖细胞相比正常者数量更少，而且其功能显著下降。为了解决上述问题，最近很多学者提出通过对EPCs基因修饰来提高EPCs的增殖、血管再生能力，从而来克服上述提到的困难，并经多项实验研究证明其可行性。

端粒酶逆转录酶基因：端粒酶逆转录 酶 （The telomeras rever transcriptase TERT）是调节细胞生命周期的关键酶，其通过催化修饰端粒酶来提高端粒酶的活性来维持端粒的稳定性，从而抑制细胞衰老或凋亡。2002年，Murasawa等通过将转染hTERT的EPCs应用于后肢循环缺血的大鼠模型中[5]，21 d后发现转染hTERT基因的EPCs的增殖、迁移、抗衰老、再生血管能力较对照组有明显增强。2012年，Shuai等通过将转染hTERT基因的EPCs移植于5/6肾脏切除的大鼠模型中，12周后发现其能减少肾间质纤维化、增大毛细血管密度来提高肾功能[6]。这为我们用TERT基因修饰EPC治疗冠心病提供理论依据。

内皮型一氧化氮合酶基因：研究表明内皮型一氧化氮合酶（NOS）是血管内皮合成一氧化氮（NO）的关键酶，其催化内皮细胞生成的NO为脂溶性的，能很快从细胞膜渗透于平滑肌细胞，使其松弛，达到扩张血管调节血管张力，同时也能渗透进入血小板，使血小板活性降低，抑制其凝集和向血管内皮的黏附，从而防止血栓的形成，防止动脉粥样硬化的发生，在维持正常血管功能中起到重要作用。最近有研究表明，血管内皮生长因子（VEGF）、促红细胞生成素、他汀类药物、雌二醇等能增加内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的分泌，从而促进EPCs迁移及提高损伤血管再内皮化能力，而采用eNOS基因敲除或NOS抑制剂能抑制EPCs修复血管内皮的功能。2014年，催等将经eNOS基因转染的EPCs经尾静脉途径作用于颈动脉内皮受损的大鼠模型中，14 d后发现转染eNOS基因组较对照组，管内膜的抗增生及改善内皮依赖性血管舒张功能明显增强[7]。

人组织型激肽释放酶基因：人组织型激肽释放酶（Human Tissue kallikrein，hTK）为激肽释放酶（kallikrein，KLK）中的一员，是激肽系统的关键酶，主要存在于胰腺、肾脏、血管等组织中，其能将低分子量激肽原（LMWK）转化为具有舒张血管、抑制心肌重构、抑制平滑肌增生及缺血再灌注损伤的保护作用的缓激肽。2013年Fu等将转染hTK-162基因的EPCs作用于后肢缺血的大鼠中[8]，21 d后发现转染hTK-162基因的EPCs组较对照组，其后肢缺血周边带的毛细血管密度及血流灌注量增加。这说明通过hTK基因的转染能增强EPCs血管再生能力。同年，Yao等将转染hTK基因的EPCs应用于急性心肌梗死小鼠模型中，发现hTK基因的过表达能增加梗死周边带毛细血管密度、抑制心肌细胞凋亡及增强左室射血功能[9]。这说明通过hTK基因的转染能增强EPCs血管再生功能，这表明经hTK基因转染的EPCs在治疗缺血性疾病中具有巨大的潜力。

蛋白激酶B与血红素氧合酶-1：蛋白激酶B（protein kinase B）又称AKT，是磷酸肌醇在细胞膜中被激活的一种蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，其在血管新生与维持血管功能中有着重要作用。2005年，Ackah等通过下调EPCs中AKT的表达，发现EPCs的迁移能力及一氧化氮生物活性降低，最终导致后肢缺血小鼠模型梗死部位的加重[10]。血红素氧合酶-1（Heme Oxygenase-1，HO-1）是血红素降解的关键酶，在血管新生的机制中起到关键作用。2007年，Deshane等发现HO-1基因敲除的小鼠中，EPCs的迁移能力及成血管功能会严重受损[11]。基于这两种酶在血管新生的特性，2012年，Brunt等通过EPCs过表达Akt与HO-1，发现EPCs的迁移、黏附及新生血管能力得到提高，从而增强了EPCs在治疗缺血性疾病的作用[12]。

展望

目前国内外已报道了多篇关于基因修饰EPCs治疗缺血性疾病的研究，其中修饰的基因的种类是多种多样的，也都显示其能增强EPCs某方面的功能，证明经基因修饰EPCs治疗缺血性疾病的效果要优于单纯EPCs移植。但是关于基因修饰EPCs移植治疗的研究目前只限于小规模的动物实验中。要充分评估这种新颖的治疗方法的安全性和临床应用于冠心病患者的有效性还有很长的路要走。但经上述关于基因修饰EPCs的研究论证，我们有理由相信，基因修饰EPCs移植治疗是个很有潜力的方法，能为临床治疗冠心病提供一个全新的途径。

[1]Asahara T,Murohara T,Sullivan A,etal.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science,1997,275（5302）：964-967.

[2]Hur J,Yoon CH,Kim HS,et al.Characterization of Two Types of Endothelial Progenitor Cells and Their Different Contributions to Neovasculogenesis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24（2）：288-293.

[3]李岚,姚玉宇,马根山.芎嗪对体外血管内皮祖细胞氧化损伤的保护作用[J].东南大学学报,医学版,2009,28（3）：180-184.

[4]Steiner S,Niesaner A,Ziegler S,et al.Endurance training increases thenumber of endothelia progenitor cells in patients with cardiovascular riskand coronary artery disease [J].Athereselerosis,2005,181：305-310.

[5]Murasawa S,Llevadot J,SilverM,etal.Constitutive human telomerase reverse transcriptase expression enhances regenerative properties of endothelial progenitor cells[J].Circulation,2002,106（9）：1133-1139.

[6]Shuai L,Li X,He Q,et al.Angiogenic effectof endothelial progenitor cells transfected with telomerase reverse transcriptase on peritubularmicrovessel in five out of six subtotal nephrectomy rats[J].Ren Fail.2012,34（10）：1270-1280.

[7]Cui B,Huang L,Fang Y,et al.Transplantation of endothelial progenitor cells overexpressingendothelialnitric oxide synthaseenhances inhibition of neointimal hyperplasia and restores endothelium-dependent vasodilatation[J].Microvasc Res,2011,81（1）：143-150.

[8]Shen Shen Fu,Fu Ji Li,Yuan Yuan Wang,et al.Kallikrein Gene-Modified EPCs Induce Angiogenesis in Rats with Ischemic Hindlim lb and Correlatewith Integrin avβ3 Expression[J].PLoSOne,2013,8（9）：730.

[9]Yuyu Yao,Zulong Sheng,Yefei Li,et al.Tissue Kallikrein-modified human endothelial progenitor cell implantation improves cardiac function via enhanced activation of akt and increased angiogenesis[J].Laboratory Investigation,2013,93：577-591.

[10]Ackah E,Yu J,Zoellner S,et al.Akt1/protein kinase Balpha is critical for ischemic and VEGF-mediatedangiogenesis[J].J Clin Invest,2005,115：2119-2127.

[11]Deshane J,Chen S,Caballero S,et al.Stromal cell-derived fator1 promotes angiogenesis via a heme oxygenase1 dependent mechanism[J].JExp Med,2007,204：605-618.

[12]Brunt KR,Wu J.Ex vivo Akt/HO-1 gene therapy to human endothelial progenitor cells enhancesmyocardial infarction recovery[J].Cell Transplant,2012,21（7）：1443-1461.

Research progressofgenemodified endothelialprogenitor cells in the treatmentof coronary heart disease

Ma Guodong,LiangWeijun（Correspondingauthor）
InternalMedicine-CardiovascularDepartment,the Affiliated HospitalofGuangdongMedicalCollege 524000

Foundation item guangdong province science and technology plan project（00300200135561018）

The pathogenesis of coronary heart disease is complex,one of the important pathogenesis is the imbalance in the coronary endothelial injury and repair.Currently,treatmentof coronary heartdiseasemainly includes drug therapy,coronary artery bypass graft,bracket intervention and so on.Endothelial progenitor cells can differentiate into endothelial cells under certain conditions,to participate in angiogenesis.But the contentof endothelial progenitor cells is very low in human tissues,it is far from enough for transplantation.In addition,several studies have shown that,compared with normal person,endothelial progenitor cells in patients with old age,diabetes,hypertension,coronary heart disease is less,and its function is significantly decreased.In recent years,many scholars put forward thatgenemodified endothelial progenitor cells can solve the above problems.The author reviews the research ofgenesmodified endothelial progenitor cells transplantation treatment,to provide new ideas for clinical treatmentof coronary heartdisease.

Coronaryheartdisease；Endothelialprogenitor cells；Genemodification

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.20.1

广东省科技计划项目（00300200135561018）