航天诱变毛霉ZY-3在腐乳生产中的应用研究

马丽，魏海霞，汪倩倩，后来旺，张宗舟*

（天水师范学院生物工程与技术学院，甘肃天水741001）

航天诱变毛霉ZY-3在腐乳生产中的应用研究

马丽，魏海霞，汪倩倩，后来旺，张宗舟*

（天水师范学院生物工程与技术学院，甘肃天水741001）

航天诱变毛霉（Mucor）ZY-3菌株是一株能够耐高温的菌株，产酶适宜温度较高，在38～42℃的条件下ZY-3的生长状况最好，蛋白酶活性达到较高范围。用ZY-3代替原始高大毛霉（Mucor mucedo）菌种接种豆腐坯，结果表明，腐乳发酵阶段抗污染力强、长势好，成品滋味鲜美。毛霉ZY-3生产的腐乳符合商业标准SB/T 10170—2007《腐乳》的要求，以颜色、风味、特色、固形物含量等作为影响论域的主要因素，进行了产品的模糊综合评价，证明毛霉ZY-3菌株可以用于腐乳生产。

航天诱变；毛霉ZY-3；腐乳；模糊评价

腐乳是用豆浆的凝乳状物制成豆坯，再经微生物发酵制得的干酪型产品[1]，在中国历史悠久，北魏时期已有记载，但一直以来没有被重视，直到20世纪50年代之前还处于“传统自然发酵时期”，60年代后才有所缓慢发展[2]。腐乳逐渐成为滋养食品及重要调味品[3-4]，其作为一种有效提升大豆效价的发酵豆制品，日益引起了国内外广大消费者、食品卫生及工业生产部门的广泛关注。但目前我国的腐乳生产仍不甚理想，生产工艺与设备技术都比较落后，仅实现了部分现代机械化，后期生产工艺仍相对落后，产品质量不稳定，生产企业各种认证未能与世界接轨[5]。

为了获得更佳口味与营养的腐乳产品[6]，将一株高大毛霉野生种通过神舟六号航天搭载，得到较为理想的突变菌种—ZY-3。并用航天诱变毛霉ZY-3对腐乳生产工艺做了改进[7]，力求最大程度的完善提高腐乳产品质量，并对最终获得的符合国家卫生标准、理化指标和感官标准的腐乳产品，借助模糊数学，构建模型将一些不易明确定量的因素进行综合评价[8-9]，旨在将毛霉ZY-3菌株用于腐乳生产，提高产品质量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验原料

豆腐、食盐、复合香辛料、辣椒粉、白酒（52度）、黄酒（15度）：市售；样品1#为市售老才臣腐乳成品；样品2#腐乳是航天诱变毛霉ZY-3制得；样品3#腐乳为市售王致和腐乳成品；样品4#是用高大毛霉野生种发酵制得的腐乳。

1.1.2 菌种

高大毛霉野生种（Mucor mucedo）、航天诱变毛霉（Mucor）ZY-3：天水师范学院微生物实验室保藏；红曲（Monascus purpureus）：浙江三禾生物工程有限公司。

1.1.3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯100 g，蔗糖10 g，琼脂10 g，水500 mL。马铃薯去皮切块，煮沸30 min后用纱布过滤，取滤液加入糖和琼脂，溶化后补足水至500 mL，121℃灭菌25 min即可[10]。

1.1.4 化学试剂

乳酸、磷酸、硼酸均为分析纯：上海微谱化工技术有限公司；Na2CO3（分析纯）：廊坊鹏彩精细有限公司；三氯醋酸、NaOH、酪素均为分析纯：青岛雅格化学试剂销售有限公司。

1.2 仪器与设备

DNP系列电热恒温培养箱：常州市万合仪器制造有限公司；AB204-N型号分析天平：上海精密科学仪器有限公司；MJ-78A灭菌锅：杭州舟倍科技有限公司；DZKW-4型电子恒温水浴锅：黄骅市渤海电器厂；722型分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；PHS-2C型精密酸度计：上海虹益仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的扩大培养

ZY-3扩大培养：麸皮，加入适量的水和磷酸二氢钾0.5%，溶液与麸皮按1∶1混合，麸皮含水量基本达到49%，装入菌种瓶中，121℃灭菌25 min，取出摇散、接种，35℃培养24 h。

1.3.2 制曲

米粉与水1∶1混合，要求含水量50%左右，至于浅盘中灭菌，浅盘内米粉的厚度1.5 cm，接入扩大后的ZY-3毛霉菌种，培养至表面长满菌丝后翻动一次最终浅盘中的米粉全部由白色毛霉菌丝覆盖，此时大曲已长好，晾晒干燥后粉碎，低温密封储藏，制曲完成。

1.3.3 ZY-3诱变毛霉蛋白酶活性的测定

蛋白酶活性的测定采用GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》中的福林法进行[11]。

蛋白酶活力的定义：1 g固体酶粉（或1 mL液体酶），在40℃（酸性pH=3.0、中性pH=7.5、碱性pH=10.5）条件下，1 min水解酪素产生1 μg酪氨酸为一个酶活力单位（U/g）。

1.3.4 腐乳（红方）的生产工艺流程及操作要点

操作要点：

前期发酵：将豆腐均匀切成3.0 cm×3.0 cm×1.5 cm的豆腐坯，入蒸锅蒸20 min，取出冷却至35℃后放入蒸笼格盘中，豆坯间隔1 cm撒上制好的曲完成接种[12]，3～4 d豆坯整个被白色的毛霉包裹，期间需要翻格2次，豆坯长好后将稍作晾晒，散去霉味。

裹料：将12%盐、辣椒、花椒、八角茴香等香料拌匀，加入少量红曲粉；取初次发酵的腐乳先均匀蘸上黄酒再裹上准备好的香料。

后期发酵：裹好料的腐乳块整齐装入发酵坛中，装好后倒入少量白酒并撒一层拌好的料对上层腐乳进行封面，上层料中适当增加食盐含量达到抑制杂菌的目的[12]，密封坛口，发酵60 d腐乳完全成熟。

1.3.5 产品质量指标测定

腐乳发酵完成后按照商业标准SB/T 10170—2007《腐乳》、GB 2712—2003《发酵豆性制品卫生标准》及GB/T 4789.232—2003《食品卫生微生物学检验冷食菜、豆制品检验》进行感官指标、理化指标及微生物指标测定。

2 结果与分析

2.1 培养温度对毛霉ZY-3蛋白酶活性的影响

蛋白酶的活性决定了产品的风味和营养品质等，通常蛋白酶有酸性、中性和碱性蛋白酶，而中性蛋白酶是3种酶中较重要的一种。在不同温度条件下测量了航天诱变毛霉ZY-3中3种蛋白酶的活性，结果见图1。

由图1可知，40℃之前随温度上升蛋白酶活性增加，尤其对中性蛋白酶效应明显，而在40℃的基础上再升温，酶活性反而下降，这说明航天诱变毛霉ZY-3蛋白酶活在40℃时最高，在生产中适宜于腐乳的发酵温度应控制在38～42℃。

2.2 食盐添加量对毛霉ZY-3蛋白酶活性的影响

由图2可知，培养物的含盐量在10%时虽然蛋白酶活最高，但此时其他杂菌的侵染不能被有效抑制，尤其是不能抑制野生酵母的生长；适当增加盐含量，当盐分为12%时杂菌明显减少而蛋白酶活稍有抑制但抑制杂菌较理想[13]，所以综合多个因素考虑腐乳生产中加盐量应控制在12%为宜。

2.3 产品质量评价

按商业标准SB/T 10170—2007《腐乳》中规定，产品红方应具有的感官特征，表面呈鲜红色或枣红色，断面呈杏黄色；滋味鲜美，咸淡适口，具有红腐乳特有气味，无异味；质地细腻，块形整齐，无杂物[7]。产品的理化及微生物指标见表1。

由表1可知，2#产品即航天诱变毛霉ZY-3菌株参与发酵制得的腐乳，其氨基酸态氮、水溶性蛋白质的含量都高于其他几个样品，凸显了ZY-3菌株用于生产腐乳时在营养、质量、生产效率中的优势；其中ZY-3型腐乳的水溶性蛋白质含量分别高出老才臣和王致和产品1.16 g/100 g、1.75 g/100 g，这说明诱变毛霉ZY-3菌株的蛋白质降解能力强，发酵过程中腐乳成熟速度快，对于生产者来说产品风味和营养不受影响的情况下意味着综合效益有所提高。

2.4 对ZY-3型腐乳的质量综合评价

技术人员10人组成评价小组，对4个产品进行投票，利用模糊综合评价模型对航天诱变毛霉ZY-3参与发酵制得的红腐乳与其他几个产品进行全面的质量评价。

2.4.1 构建模糊评价模型

影响因素的集合组成论域U=｛颜色，味道，块形，质地，固形物含量，特色｝；设计因素的评价等级I=｛i1，i2，i3，i4，i5｝，分别表示产品在各个影响因素的等级为特级、高级、一级、二级、合格。即I集合是对论域U中的各元素如颜色、块形、质地细腻度、味道和固形物含量等的复合关系。各个影响因素权重的集合，即为权重矩阵M=｛m1，m2，m3，m4，m5，m6｝由评价小组人员参考SB/T 10170—2007《腐乳》行业标准决定权重比例[14-15]。该实验中确定因素权重矩阵M=｛0.1，0.2，0.15，0.2，0.25｝。

2.4.2 对投票数据的处理和分析

对于某同类产品1、2、3…，定义矩阵C为模糊关系矩阵；其中Cij≥0任意i、j，j=1、2…n。Cij表示某产品的第j个影响因素在评判小组成员的评判下基本属于等级i的范畴，即Cij作为评判人员对第j个影响因素在i等级下的评判关系系数。

考虑所有因素的综合影响，定义最终模糊综合评价参数的矩阵为Dx=M×Cm（其中m为不同产品），最终评价总分P=Dx·In（n为某一影响因素对应的不同评价等级的赋值）。

D1=M×C1

d11=0.02+0.06+0.01+0.045+0.14+0.1=0.375，同理d12= 0.44，d13=0.155，d14=0.03，d15=0，d16=0。所以，根据上式运算得D1=｛0.375，0.44，0.155，0.03，0｝同一个产品所有因素的模糊综合评价参数之和为1，即0.375+0.44+0.155+0.03=1。按评价等级从高到低分别赋于分值5、4、3、2、1则，1#产品最终得分P1=0.375×5+0.44×4+0.155×3+0.03×2=4.16分。同理将所有样品投票分值结果见表2。

通过上述模糊综合评价后可以得出结论，对于不同的几种腐乳产品1#、2#、3#、4#的总分排名次序为2#＞1#＞3#＞4#，这说明经过模糊综合评价，航天诱变毛霉ZY-3菌株生产的腐乳产品各方面都优于高大毛霉野生种生产的腐乳，而且质量指标也优于部分市售腐乳。

3 结论

随着市场竞争和消费者要求的不断提升，腐乳生产者需要不断改进生产工艺，菌种改良是整个生产工艺的关键，腐乳的发酵程度、风味特色、成本都与菌种关系密切；本实验中利用航空搭载，选育出高大毛霉诱变种，ZY-3号毛霉，它从蛋白酶活、耐高温、抗污染等内在因素及菌丝的长势、长度、洁白程度等外观因素来说都是一株优良菌种。

对航天诱变毛霉ZY-3进行腐乳发酵测试，与市售腐乳对比发现，ZY-3型腐乳的氨基酸态氮和水溶性蛋白质含量都高于市售产品，且腐乳颜色纯正，表面无杂物，风味突出。进一步通过构建模糊综合评价模型对ZY-3腐乳产品的感官指标和理化指标综合分析，结果显示，ZY-3型腐乳质量综合分值较高，并满足相关标准要求。

[1]HAN B Z,ROMBOUTS F M,NOUT M J R.A Chinese fermented soybean food[J].Int J Food Microbiol,2001,65(1-2):1-10.

[2]刘亚，杨光影，吴悦，等.腐乳研究进展[J].农产品加工，2013（12）：12-15.

[3]李理特.传统大豆食品的挑战与机遇[J].食品与营养，2003（3）：5-8.

[4]蒋芳芳，刘嘉，蒋立文.腐乳品质改善的研究进展[J].中国酿造，2011，30（11）：1-5.

[5]邵伟，刘世玲，肖汶，等.全发酵腐乳生产工艺的研究[J].中国酿造，2002，21（2）：12-13.

[6]尹喆.毛霉低盐腐乳粉的制备及影响因素研究[D].天津：天津科技大学硕士论文，2009.

[7]中华人民共和国商务部.SB/T 10170—2007腐乳[S].北京：中国标准出版社，2007.

[8]王瑞芝.中国腐乳酿造[M].北京：中国轻工业出版社，2009.

[9]相飞，汪立平.传统甜酒曲的模糊综合评价及优势丝状真菌的分离鉴定[J].食品与发酵工业，2014，40（8）：78-81.

[10]沈萍，陈向东.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，2007.

[11]王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学[M].北京：高等教育出版社，2002.

[12]巩晓芳，张宗舟，薛林贵，等.航天诱变毛霉ZG-2菌株产蛋白酶条件优化[J].河南农业科学，2013，42（4）：164-167.

[13]张宗舟，张扬，陈志梅.酿造工艺学[M].北京：光明日报出版社，2010.

[14]张宗舟，赵慧.酿造产品感官质量的模糊综合评价[J].中国食品工业，2011（3）：23-28.

[15]张宗舟，赵慧.酿造工艺模糊综合评价分析[J].中国酿造，2011，30（5）：147-149.

MA Li,WEI Haixia,WANG Qianqian,HOU Laiwang,ZHANG Zongzhou*
(College of Bioengineering and Technology,Tianshui Normal University,Tianshui 741001,China)

MucorZY-3 is a space mutation strain with high temperature resistance,and it is suitable in high temperature for enzyme production.The optimal growth temperature for strain ZY-3 growth was 38-42℃,and the protease activity reached a high range.Tofu pehtze was inoculated with strain ZY-3 instead of the originalM.mucedo,and the results showed that sufu showed strong anti-pollution ability,good growth and delicious taste.Several kinds of sufu fermented by strain ZY-3 conforming to SB/T 10170—2007 were evaluated by fuzzy comprehensive evaluation,using color,flavor, characteristics,and solid content as main evaluation factors.It was proved that strain ZY-3 could be used in the production of sufu.

space mutation;MucorZY-3;sufu;fuzzy evaluation

Q933

A

0254-5071（2015）04-0062-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.014

2015-03-11

2010甘肃省自然科学基金项目（1010RJZE029）

马丽（1992-），女，本科生，研究方向为应用微生物。

*通讯作者：张宗舟（1957-），男，教授，博士，研究方向为应用微生物。