自然发酵蔬菜制品中降解亚硝酸盐乳酸菌的分离与鉴定

朱军莉，赵 进，朱雅霏

（1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州310018；2.中国计量学院生命科学学院，浙江杭州310018；3.浙江蔡小珍农业开发有限公司，浙江建德311600）

自然发酵蔬菜制品中降解亚硝酸盐乳酸菌的分离与鉴定

朱军莉1，赵 进2*，朱雅霏3

（1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州310018；2.中国计量学院生命科学学院，浙江杭州310018；3.浙江蔡小珍农业开发有限公司，浙江建德311600）

以自然发酵蔬菜为原料，采用平板计数和钙溶圈法分离纯化菌株，并分析菌株的亚硝酸盐降解能力。结果表明，钙溶圈法分离的产酸能力较强的9株细菌，经生理生化鉴定均为乳酸菌。乳酸菌在MRS培养基中都具有亚硝酸盐分解能力，其中H12、L7和X1三株乳酸菌亚硝酸盐降解率高于89%，且降解速度较快，其中X1降解亚硝酸活性最强。乳酸菌X1还表现良好的产酸能力和耐盐性，经16S rDNA鉴定为植物乳杆菌(Lactobcillus plantarum)。

乳酸菌；亚硝酸盐降解；分离；鉴定

泡菜是以白菜、甘蓝、萝卜等为原料，经洗涤、切分处理后，加入一定浓度的食盐溶液，再经乳酸发酵等制成的一种传统的乳酸发酵蔬菜制品。泡菜质地脆嫩，形态饱满，酸咸适度，清脆爽口，营养丰富，其富含维生素和钙磷等无机物及乳酸菌活菌对提高健康水平有着积极作用。目前，泡菜制作大都采用自然发酵法，其缺点是发酵周期长，产品质量不稳定，杂菌污染严重，亚硝酸盐含量超标等。

大量研究证实，泡菜在腌制发酵过程中形成亚硝酸盐，其含量超标是一直困扰着蔬菜腌制厂家的难题，也是成为制约泡菜发展的重要因素之一。具有硝酸还原能力的微生物污染是蔬菜在发酵过程中产生亚硝酸盐的根本原因。在腌制和发酵初期，污染细菌中分泌的硝酸还原酶将蔬菜中的硝酸盐还原为亚硝酸盐[1]。亚硝酸盐在酸性条件下，即可形成N-亚硝酸胺类化合物，该类物质具有强致癌性[2]。我国食品卫生法规定了腌制品中亚硝酸含量＜30 mg/kg，世界卫生组织（world health organization，WHO）也规定亚硝酸的每日允许摄入量（acceptable daily intake，ADI）值为0.4 mg/kg。

人工接种乳酸菌发酵泡菜是一种发酵技术现代化的趋势，具有缩短生产周期，改善泡菜品质，有效抑制杂菌，降低亚硝酸盐含量的优点[3]。研究表明，乳酸菌对亚硝酸盐具有降解转化能力[3-8]，但是存在菌种及菌株间的差异[9]，因此筛选降亚硝酸能力较好、适合泡菜发酵的乳酸菌菌种具有重要意义。本研究从自然发酵的泡菜中筛选和分离乳酸菌，并获得能有效分解亚硝酸盐的菌株，为进一步研制泡菜发酵菌种乳酸菌剂和初步应用奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酱黄瓜、腌萝卜、酱黄花菜、榨菜：购于杭州翠苑一区菜市场；雪菜样品：浙江蔡小珍农业开发有限公司。

MRS液体和固体培养基：青岛高科园海博生物技术有限公司；生化发酵管：杭州微生物试剂有限公司；16S rDNA的PCR扩增引物合成和测序均在上海生物工程技术有限公司；亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

BI-150A低温生化培养箱：施都凯仪器设备有限公司；SW-CJ-2D FRESCO 17微量台式离心机：美国赛默飞世尔科技有限公司；UV-1800型分光光度计：日本岛津公司；FE20型pH计：梅特勒-托利多上海有限公司；SW-CJ-2D净化工作台：苏州净化有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌计数

无菌条件下各取25 g样品于225 mL无菌生理盐水中拍打稀释，为1∶10稀释液，并用无菌水制备不同的稀释度样品，选取适当的稀释度，吸取1 mL在无菌平板上，用MRS琼脂倾注法混匀，30℃厌氧培养48h，按照国标GB4789.35—2010《食品微生物学检验乳酸菌检验》中的方法计数。

1.3.2 乳酸菌的分离

同上选取适宜的稀释度，用含2%碳酸钙的MRS固体培养基倾注平板，于30℃厌氧培养48 h，挑取有明显溶钙圈的菌落，在MRS平板上划线纯化，经革兰氏染色和接触酶反应，筛选出革兰氏阳性、接触酶阴性菌株，划线在MRS斜面培养基，于4℃条件下保藏。

1.3.3 乳酸菌的生理生化鉴定

取过夜培养的分离株接种在明胶、吲哚、硫化氢、山梨醇、木糖、葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、七叶苷及淀粉微量生化发酵管中，37℃厌氧培养48 h，观察结果。参照《常用细菌系统鉴定手册》中相应的指标进行比对。

1.3.4 亚硝酸盐含量的测定

亚硝酸盐含量的测定按照国标GB 5009.33—2010《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的盐酸萘乙二胺法，根据不同质量浓度的标准NaNO2溶液中分别加入2 mL对氨基苯磺酸溶液，混匀，放置3～5 min，加入1 mL盐酸萘乙二胺溶液，于波长538 nm处测定吸光度值，绘制标准曲线。根据亚硝酸钠标准曲线回归方程，计算样品中亚硝酸盐含量。

1.3.5 降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选

初筛：将乳酸菌9个菌株按体积分数为2%的接种量接种于10 mL含亚硝酸钠125 mg/L，pH值为6.4的MRS液体培养基中培养，于30℃培养48 h，以含NaNO2不接种培养基为对照，测定亚硝酸盐降解率。

复筛：在含NaNO2（125 mg/L）的MRS液体培养基中培养菌株H22、L7和X1，每隔12 h测定亚硝酸盐降解率。同时，将H22、L7和X1培养48 h的发酵液离心取上清液，在上清液中添加NaNO2至125mg/L，混合液置于30℃培养箱中，每隔12h测定亚硝酸盐含量，以灭菌未培养的MRS中添加NaNO2为对照。亚硝酸盐降解率计算公式：

1.3.6 菌株生长曲线和产酸特性测定

将乳酸菌菌株X1按体积分数为2%的接种量接种于10 mL MRS液体培养基，30℃培养，每隔2 h按照比浊法于波长600 nm处测定细菌细胞生长量，并测定pH值。以培养时间为横坐标，对应的吸光度值、pH值为纵坐标绘制菌株X1生长曲线和产酸特性曲线。

1.3.7 16S rDNA鉴定

细菌基因组DNA的抽提，参考朱军莉等[11]的方法提取。以抽提X1细菌DNA组作为聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增的模板，16S rDNA PCR扩增的通用引物为引物。PCR产物电泳分析及纯化后测序。测序得到的序列通过http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/上的基本本地队列搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）在GenBank基因库进行同源性比较。

2 结果与分析

2.1 自然发酵样品的乳酸菌数分析

5种常见自然发酵泡菜样品中的乳酸菌总数如图1所示。由图1可知，腌萝卜和黄花菜样品中乳酸菌落数较多，菌落总数对数值分别为5.48和5.59，而榨菜中菌落总数次之，对数值为4.97，而雪菜和酱黄瓜中菌落总数较少，对数值为3.32和2.98。5种自然发酵样品中乳酸菌数存在明显差异，其中腌萝卜和黄花菜中乳酸菌含量较高，可能与原料的品种、样品发酵阶段、贮藏时间均有关系。

2.2 乳酸菌的分离与生理生化鉴定

采用溶钙圈法，将稀释样品在含CaCO3的MRS平板上计数，培养72h，挑取溶解圈较大、圆形、乳白色、湿润的45个菌落。经革兰氏染色和接触酶实验，初步筛选得到9株菌株，进行生化鉴定，结果见表1。由表1可知，9株乳酸菌均呈革兰氏阳性、杆状，接触酶阴性，吲哚实验阴性，不产硫化氢，发酵木糖、果糖、甘露醇、乳糖、七叶苷，大部分能发酵山梨醇、葡萄糖、阿拉拍糖、蔗糖和淀粉，其与乳酸菌的特征较一致。

2.3 降解亚硝酸盐乳酸菌的初筛

将筛选的9株菌按2%接种量接入含125 mg/kg的亚硝酸盐MRS液体培养基中，培养48 h后检测亚硝酸盐的含量，结果见图2。由图2可知，9株乳酸菌均具有分解亚硝酸的能力，其中H12、L7和X1显示分解亚硝酸盐的效果较好，降解率达到88%以上。而H11和H22分解能力次之，为73%～82%，H1和L17亚硝酸盐分解率为62%～64%，H10和L8分解率较低为32%～48%。选择降解亚硝酸盐能力强的菌株H12、L7和X1进行复筛。

2.4 降解亚硝酸盐乳酸菌的复筛

菌株H12、L7和X1降解亚硝酸盐的复筛结果见图3。由图3a可知，H12、L7和X1降解亚硝酸盐速度较快，经过36 h的培养，亚硝酸盐降解率达到80%以上，72 h亚硝酸盐降解率分别为89.2%、90.7%和95.6%，其中X1表现最强的降解亚硝酸能力，且降解速度较快。上清液分解亚硝酸盐的能力结果见图3b。由图3b可知，上清液中亚硝酸的分解率明显低于共培养条件，在处理24 h后降解速度缓慢，经72 h处理后H12、L7和X1上清液中亚硝酸盐的降解率分别为44.2%，42.7%和50.7%，表明上清液也具有亚硝酸盐降解作用。

研究表明，乳酸菌对亚硝酸盐的降解作用有酶降和酸降两种方式，在pH值＞4.5时乳酸菌对亚硝酸的降解以亚硝酸盐还原酶作用为主[2]，可能是pH≤4.5能够抑制该酶的活性。而发酵后期较低的pH能够快速降解亚硝酸盐[7]。研究表明，植物乳酸菌能分泌亚硝酸还原酶，应碧等[12-13]分析了亚硝酸盐还原酶的相关基因及酶学特点。复筛结果表明，X1表现很强的亚硝酸盐降解能力，其速度很快。发酵后上清液也具有亚硝酸盐分解作用，表明亚硝酸盐的降解是酶催化和有机酸分解共同作用的结果。

2.5 乳酸菌X1产酸能力

菌株X1生长曲线和产酸特性曲线见图4。由图4可知，菌株X1菌株在4 h开始进入对数生长期，在18 h进入生长稳定期。菌液的pH值随着菌株的生长逐步下降，其产酸速率和菌体的生长速度成正相关趋势，进入稳定期后，溶液中的pH值也趋向于平稳，最低pH值为3.85。结果表明，该菌有较强的产酸能力，培养24 h后低pH可能参与亚硝酸盐的降解。

2.6 16SrDNA鉴定

抽提对数生长末期菌株X1的DNA，以乳酸菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图5。

由图5可知，获得了特异的、大小约为1.5 kb的扩增条带。获得特异片段经纯化和测序后，通过BLAST与GenBank核酸序列库中的序列进行比对，发现X1与植物乳杆菌的相似性都超过99%。结合生理生化的鉴定结果，X1鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。杜晓华等[5]也报道从四川泡菜中分离降解亚硝酸盐是植物乳杆菌，韩新峰等[14]也发现植物乳酸菌纯种半固体发酵制作泡菜亚硝酸盐含量较低，且品质优于纯种液态发酵和自然发酵泡菜。李欣等[15]从大庆自然发酵酸菜中分离的14株耐酸乳酸菌中5株为植物乳杆菌。

3 结论

本研究对传统5种泡菜乳酸菌计数，并从45株乳酸菌中筛选出9株具有较大溶钙圈的菌株。生理生化鉴定发现9个分离株均为乳酸菌，并具有亚硝酸盐降解活性，其中X1、H12和L7在MRS培养基中降解亚硝酸盐活性高于89%，而3株菌48 h发酵后上清液也具有亚硝酸盐分解作用，表明乳酸菌降解亚硝酸盐是酶解和酸解共同参与。乳酸菌X1具有良好的产酸能力，经鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），此研究为发酵泡菜优良乳酸菌菌种的筛选和应用奠定了良好基础。

[1]孟良玉，兰桃芳，何余堂.酸菜中亚硝酸盐含量变化规律及降低措施的研究[J].中国酿造，2005，24（11）：13-14.

[2]李幼筠，周逦.泡菜酿造剖析[J].中国酿造，2013，32（3）：1-7.

[3]李幼筠，周逦.我国发酵调味品应用微生物剖析[J].中国酿造，2012，31（4）：27-32.

[4]张庆芳，迟乃玉，郑燕，等.乳酸菌降解亚硝酸盐机理的研究[J].食品与发酵工业，2002，28（8）：55-60.

[5]杜晓华，刘书亮，蒲彪，等.四川泡菜中降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选鉴定及其应用[J].食品与发酵工业，2012，39（4）：48-52.

[6]韩梅，王衍强，彭帅，等.降解亚硝酸盐乳酸菌的分离与鉴定[J].沈阳农业大学学报，2011，42（2）：216-219.

[7]马延岩.泡菜发酵过程中亚硝酸盐生成及降解机理研究[J].食品科技，2013，38（10）：227-280.

[8]张冬梅，于康宁，涂强.泡菜纯种发酵优良乳酸菌的筛选及菌株特性研究[J].中国酿造，2008，27（16）：22-26.

[9]辛博，吕嘉枥，王笋.乳酸菌和酵母菌对浆水发酵过程中亚硝酸盐的影响[J].食品科技，2014，39（1）：10-14.

[10]张庆芳，迟乃玉，郑学仿，等.短乳杆菌（Lactobacillus brevis）去除亚硝酸盐的研究[J].微生物通报，2004，31（2）：55-60.

[11]朱军莉，王晔，励建荣.生物保鲜乳酸菌的筛选及其细菌素特性研究[J].中国酿造，2010，29（5）：42-46.

[12]应碧，昌晓宇，刘志文，等.亚硝酸盐胁迫下植物乳杆菌WU14亚硝酸盐还原酶的食品级高效诱导表达及其酶学性质研究[J].中国农业科学，2015，48（7）：1415-1427.

[13]何婷婷，龚钢明，高然.植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶相关基因的研究[J].食品工业，2015，36（2）：191-194.

[14]韩新锋，刘书亮，张艾青，等.产细菌素植物乳酸菌纯种半固态发酵对泡菜品质的影响[J].中国酿造，2012，31（7）：72-76.

[15]李欣，武俊瑞，田甜，等.大庆自然发酵酸菜中乳酸菌的分离鉴定及耐酸菌株初步筛选[J].食品科学，2014，35（1）：150-154.

Isolation and identification of nitrite-degrading lactic acid bacteria from natural fermented vegetable

ZHU Junli1,ZHAO Jin2*,ZHU Yafei3
(1.College of Food Science and Biotechnology Engineering,Zhejiang Gongshang University,Hangzhou 310038,China; 2.College of Life Science,China Jiliang University,Hangzhou 310018,China; 3.Zhejiang Caixiaozhen Agricultural Development Company,Jiande 311600,China)

Bacteria with high nitrite degradation ability were isolated from natural fermented vegetable by plate count method and calcium dissolved ring method.Nine strains with strong acid production ability were screened and identified as lactic acid bacteria by physiological and biochemical identification.The nitrite degradation ability in MRS liquid medium differed among nine strains,strain H12,L7 and X1 exhibited rapid nitrite degradation rate of higher than 89%.Strain X1 showed the strongest ability for nitrite degradation,and it also showed strong ability of acid production and salt resistance,which was identified asLactobcillus plantarumby 16S rDNA sequencing.

lactic acid bacteria;nitrite degeneration;isolation;identification

TS255.54

A

0254-5071（2015）06-0039-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.009

2015-05-20

杭州市科技局项目（30130432B104）

朱军莉（1979-），女，副教授，博士，研究方向为食品微生物。

*通讯作者：赵进（1977-），男，副教授，博士，研究方向为食品生物技术。