酱香型白酒酿造体系中酵母菌研究进展

陈美竹，邱树毅，胡宝东，王 婧，徐 佳，王晓丹，3*

（1.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳550025；2.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；3.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025）

酱香型白酒酿造体系中酵母菌研究进展

陈美竹1，3，邱树毅1，2，胡宝东1，2，王 婧1，2，徐 佳1，2，王晓丹1，2，3*

（1.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳550025；2.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；3.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025）

本文综述了酱香型白酒从制曲、堆积到窖内发酵过程中酵母的多样性、消长规律、功能及应用的研究，并概述了用于分析酱香型白酒生产中酵母的相关技术。多角度认识酱香型白酒生产过程中的酵母，对揭示酱香型白酒发酵机理及提高白酒质量有一定的借鉴，亦对控制酱香型白酒生产工艺的稳定性和规范性具有指导意义。

酵母；消长规律；多样性；功能；应用；分析技术

酵母是白酒酿造微生物家族中不可或缺的一类微生物，从酱香型白酒制曲到酿造过程一直可以检测出，直接关系到产酒率，且能够代谢产生大量不同的风味物质，对酱香型白酒风格的形成具有重要作用。对酱香型白酒大曲和酿造过程中的酵母进行研究，揭示酿造工艺中酵母消长规律及群落结构，认识微生态环境中酵母作用及其与微生态环境中各种微生物之间的代谢关系，能进一步发挥酵母资源在白酒生产中的作用，提高酵母生物经济学价值，也为深入研究酱香型白酒发酵机理及呈香机制提供基础数据和理论依据，并对实际生产具有指导意义。

1 酱香型白酒大曲酵母研究概况

1.1 酱香型白酒大曲酵母消长规律

高温制曲是酱香型白酒生产的一大特色，曲砖发酵长达40 d，发酵中后期品温达60℃以上，这为耐高温微生物提供了良好的生长环境。酵母菌特殊的细胞结构特性能使其对高温的承受能力有限，因而酵母主要在制曲过程的前期大量繁殖，一般占2%～5%，而后期很少或未检测到酵母菌[1]。崔福来等[2]利用传统分析方法考察了酱香型白酒高温大曲发酵过程中微生物种类及消长规律，发现酵母菌在大曲发酵初期继续生长繁殖，但随着曲温上升而逐渐消失，从而在高温成品大曲中不能或仅能少量检出酵母菌。本课题组现阶段利用纯培养技术对多种酱香高温成品大曲中酵母的计数结果表明，大曲中的酵母数量较少，约为103CFU/g，酵母菌的数量远远少于细菌和霉菌的数量[3]。利用现代分子生态学技术对酱香型白酒大曲中的微生物群落结构的分析亦表明，酱酒大曲中酵母数量约占大曲微生物文库的2.6%[4]。尽管高温制曲工艺降低了曲中酵母的数量，但仍然有部分酵母存活或处于休眠状态，并且成品曲出房后及贮存过程中，能在常温条件下继续网络周围环境中的酵母，因而能够在大曲中检测出少量酵母。利用Biolog-ECO技术来对高温大曲不同贮存过程中的大曲微生物多样性变化规律进行研究，表明大曲在贮存过程中曲样微生物群落结构能够发生小幅度的变化[5]。

1.2 酱香型白酒大曲酵母多样性

制曲过程出现的酵母对大曲香味物质及前体形成具有重要作用，而成品曲中的酵母又能够通过撒曲进入制酒过程进行发酵和产香，因而研究整个制曲过程中的酵母十分必要。目前，利用纯培养技术分离酱香型白酒大曲中酵母的研究取得了一定的成果。茅台酒厂技术中心在2001—2006年对茅台酒制曲发酵过程中微生物的消长规律做了系统的研究，共分离到了18种酵母，包括假丝酵母（Candidasp.）、丝孢酵母（Trichosporonsp.）、汉逊酵母（Hansenulasp.）、异常汉逊酵母（Hansenula anomala）、毕赤酵母（Pichiasp.）、红酵母（Rhodotorulasp.）、拟内孢霉（Endomycopsissp.）、白地霉（Geotrichum candidum）等酵母[6]。本课题组从酱香大曲中还分离到了Candida kruisii、伯顿毕赤酵母（Pichia burtonii）、扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）、异常毕赤酵母（Pichia anomala）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、Trichosporon terricola、Trichosporon dermatis等酵母[7-8]。此外，其他研究还从酱香大曲中分离到了卡斯特假丝酵母（Candida casterllani）、Zygosaccaromyces cidrci、Hyphichia burtoniia、Pichia galeiformis、费比恩毕赤酵母（Pichia fabianii）、拜耳结合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、Stephanoascus ciferrii、Pichia meyerae、Cryptococcus neoformans、Trichosporon jirovecii、Trichomonascus ciferrii等酵母[1，4，9-10]。引入现代分子生态技术来研究酱香大曲中的酵母，发现曲中还存在Candida silvae、热带假丝酵母（Candida tropicalis）等酵母，而扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和异常毕赤酵母（Pichia anomala）是酱香大曲中的优势酵母，而酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在大曲中处于弱势地位，对酱香型大曲中酵母结构组成进行了补充[10]。随着技术的发展和研究的深入，大曲中酵母多样性和消长情况必将更加完善，为酱香大曲的科学生产和管理提供理论依据。

2 酱香型白酒堆积过程酵母的研究

2.1 酱香型白酒堆积过程酵母消长规律

酱香型白酒高温制曲工艺限制了大曲中酵母的数量，无法为窖内发酵过程提供充足的酵母资源，因而需要在堆积过程实现酵母的富集，并在微生物和酶的作用下为酵母提供足够可供窖内发酵的糖、香味物质前体等原料。了解堆积过程中酵母的变化规律和微观组成对认识堆积发酵机理具有重要作用。目前对堆积过程中酵母的研究已经取得了一定的成果。课题组对酱香型白酒整个生产周期不同堆积过程中酵母数量变化进行了系统的研究，表明酵母在堆积后数量明显增加，增加幅度可达到1～3个数量级，但增加幅度因堆积轮次和车间而异[3]。贵州省轻工业科学研究所对堆积过程中酒醅各层酵母随堆积时间而发生的变化做了系统的研究，表明随着发酵时间的推进，受堆子中各位点的温度、酸度和氧浓度的差异的影响，发酵酒醅堆各层面、各部位的酵母菌总量呈现明显差异，其中以堆上和堆中酵母数量增长最快[11]。四川省农业科学院研究所对郎酒堆积过程中酵母变化进行研究，表明堆上、堆中和堆心中的酵母数量均在第2天时达到高峰，此后呈下降趋势；整个过程中，酵母菌数量增幅能达到5个数量级；堆积终了时酵母是堆积酒醅中主要的微生物，且表层酵母菌占总数的73%以上[12]。可见堆积过程调控了酒醅中酵母的数量，为后续发酵提供了足够的动力。

2.2 酱香型白酒堆积酒醅中酵母多样性

目前，对酱香白酒堆积酒醅中酵母结构的研究已经到了一定阶段。通过对茅台酒厂堆积酒醅进行研究，已经分离到了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、克鲁斯假丝酵母（Candida krusei）、汉逊酵母（Hansenulasp.）、异常汉逊酵母（Hansenula anomala）、丝孢酵母（Trichosporon sp.）、假丝酵母（Candidasp.）、白地霉（Geotrichum candidum）、意大利酵母（Saccharomyces italicus）、地生酵母（Saccharomyces telluris）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、间型假丝酵母（Candida intermedia）、卡尔斯伯酵母（Saccharomyces carlsbergensis）、球拟酵母（Torulopsis sp.）、掷孢酵母（Sporobolomycessp.）等[11，13-14]。其他研究从酱香型白酒堆积酒醅中分离到的酵母有Pichia galeiformis、拜耳结合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、费比恩毕赤酵母（Pichia fabianii）、Stephanoascus ciferrii、Pichia meyerae、膜醭毕赤酵母（Pichia membranifaciens）、栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce spombe）、Candida apicola、白地霉（Galactomyces geotrichum）、胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、Kazachstania exigua、汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）、Carl Bloomsbury yeast、Candida krusei、Trichosporon yeast、Throw toruloides、Hyphichia Burtoniiai等酵母[9，11]。这些研究不断对酱香型白酒堆积酒醅中酵母组成进行补充，并且随着研究的深入，对其认识将更加全面。

2.3 酱香型白酒堆积酒醅中酵母的来源

堆积过程能够富集大量酵母，但是这些酵母是来自于大曲还是环境。目前，学术界和白酒行业对酒醅中酵母的来源还存在争议，研究也在不断进行。珍酒酒厂对堆积过程酵母变化进行研究，表明随着堆积时间的推进，酵母种类持续增加[15]。茅台酒厂技术中心从制酒堆积和发酵过程中分离到了85种微生物，包括28种酵母，其中有至少7种酵母源于茅台大曲，其他微生物主要来源于空气、场地和生产用原辅料[6]。通过对某酱香型白酒厂整个生产周期中大曲、空气、出甑酒醅、摊凉后未加曲酒醅、加曲后酒醅等样品中的酵母分别进行检测，表明曲粉与空气中的酵母进入了酒醅中，但是对酒醅中酵母的贡献小于摊凉地面，明确了摊凉地面是酱香型白酒酒醅中酵母的主要来源[9]。由此可见，除高温大曲以外，环境因素对酒醅中酵母的富集亦具有重大贡献。

3 酱香型白酒窖内发酵过程中酵母的研究

堆积结束后，酒醅入窖池进行厌氧发酵，是产酒的关键时期。酵母是乙醇发酵的主要动力，因而研究窖池内部酵母结构和变化，对认识和科学指导窖内发酵过程意义重大。

3.1 酱香型白酒窖内酒醅中酵母消长规律

酒醅中酵母的变化因时间和空间而异。从时间的角度看，酒醅入窖之后，酵母菌数量随着发酵时间的推进呈现出下降的趋势。郎酒厂通过对第四轮次入窖酒醅中酵母菌进行跟踪，表明酵母在进入窖池发酵后，虽然各层酵母数量在不同发酵时间显现出回升的显现，但酵母总体数量呈下降趋势，能从入窖时的108CFU/g糟下降至出窖时的104CFU/g糟[16]。习酒技术中心通过对多轮次窖内发酵过程进行研究，表明随着窖内发酵时间的推移，酒醅中酵母总数量与各醅层中酵母数量变化一致，均呈急剧-缓慢下降的趋势[17-18]。窖内发酵过程中的酵母主要源于堆积过程所繁殖的酵母，这也反应出堆积过程对窖内过程具有重要作用。酵母菌入窖发酵过程中呈现出的数量下降趋势可能是因为随着发酵进行，窖池内氧气和营养物质逐渐被消耗，代谢产物积累，酸度升高等环境因素的改变，导致了酵母的逐渐衰亡。此外，通过对酱香型白酒生产多轮次入窖酒醅进行对比分析，发现那些酒质较差轮次酒醅中的酵母数量明显少于那些酒质好轮次酒醅中酵母的数量，而各轮次中酵母数量下降速率因各轮次酒醅温度、营养物质和代谢物含量不同而异[17]。

从空间的角度来看，酱香型白酒酒醅不同醅层中酵母分布具有明显差异。课题组对酱酒厂3个不同窖龄窖池中酵母数量变化进行了跟踪，发现无论是对于新窖池还是老窖池来说，酵母总体分布趋势均是上层酵母数量最多，其次是中层，而下层酵母数量最少[3]。郎酒酒厂和习酒酒厂也有相似的研究报道[12]。发酵过程中，上层酒醅中酒精含量高于中下层，这与糟醅中酵母的数量变化趋于一致[16]。在某种程度上，上层酒醅可能通过封窖泥中缝隙与外界实现了气体交换，使得越靠近上层的酒醅中氧气浓度高于靠中下层的酒醅中的氧气浓度，因而上层酒醅环境更适宜酵母的生长，这可能是酵母在窖内空间分布差异的原因之一。

3.2 酱香型白酒窖内酒醅中酵母多样性

江南大学对酱香型白酒窖内发酵过程中酵母的结构组成做了比较全面的研究。以传统分析方法对酱香型白酒窖内发酵过程中酵母组成变化进行跟踪，发现同一轮次三层酒醅中酵母种属基本没有差别，但是优势酵母种类随发酵时间推进，发生了明显变化；Pichia galeiformis、拜耳结合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce spombe）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是不同轮次窖池发酵上层酒醅中主要的4种酵母，但是优势酵母的种类因轮次而异，表现为拜耳结合酵母（Zygosaccharomyces bailii）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是二、三、四轮次中最主要的2种酵母，随发酵时间推进，栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce spombe）成为了五、六、七轮次中的优势酵母，而Pichia galeiformis数量随轮次进行一直在降低；从窖内酒醅中还分离得到了Pichia fabianii、白地霉（Geotrichum candidum）、Pichia meyerae、膜醭毕赤酵母（Pichia membranifaciens）等酵母[10]。以变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术分别对酒质好与酒质差的两个轮次发酵过程中的酵母群落结构进行解析，表明两轮次中优势酵母的种类不同，酒质较好的轮次中酵母数量更多，种类也更为丰富；随发酵时间推进，酒质较好的轮次比酒质较差的轮次中酵母群落结构更为稳定；检测出东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）、戴尔凯氏有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）、Pichia galeiformis、栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce spombe）、白地霉（Galactomyces geotrichum）、Trichosporon asahii、拜耳结合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、费比恩毕赤酵母（Pichia fabianii）等9种酵母[18]。同时茅台酒厂对窖池中酵母研究表明拜耳结合酵母（Zygosaccharomyces bailii）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是上层酒醅中的优势酵母，且酒质较好的轮次酵母生物量多于酒质较差轮次，这同上述研究均具有相似性[17]。此外，对北大仓白酒窖池中酵母组成进行跟踪分析，表明在其生产发酵过程中酵母菌的组成和分布相对稳定，嗜酒假丝酵母（Candida ethanolica）、异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、Candida humilis、布鲁塞尔德克酵母（Dekkera bruxellensis）、栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce spombe）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）、库德毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是常见酵母，而Pichia manshurica、Kazachstania barnettii、Kazachstania exigua、Pichiaanomala等酵母属于稀有酵母[19]。课题组对酱香型白酒窖池中酵母进行归类分析，发现窖内酵母主要归为五大类，包括酿酒酵母属（Saccharomyces）、红酵母属（Rhodotorula）、毕赤氏酵母属（Pichia）、假丝酵母属（Candida）及伊萨酵母属（Issatchenkia），这些酵母在上层酒醅中均有检出，但在中层和下层酒醅中存在一定的差异[3]。

4 酱香型白酒功能酵母研究及应用

从制曲、堆积到入窖发酵，酵母在白酒整个生产过程中均可以检测到，是白酒酿造过程中的重要的三大菌群之一。研究酱香型白酒生产中的酵母，不仅能够为认识酱香型白酒发酵机理提供依据，而且能将其应用到白酒的生产中，提高酵母资源的利用率和酱香型白酒的质量。

4.1 酵母主要功能的研究

白酒生产中，酵母从功能上主要将分为两大类。一类是产酒酵母，其发酵能力强，主要影响产酒率；另一类是产脂酵母，其发酵效率低，但能以糖、醛、有机酸、盐类等作为养料，在酯酶的作用下将醇酸结合而产生酸酯物质，从而赋予酒体浓郁的芳香，对酒体完美和丰满具有重要作用，因而又称为生香酵母。

4.1.1 产酒酵母的研究

在酒精生产中，考虑到实际生产成本以及随着发酵进行带来的条件改变，往往需要生产菌种具有良好的发酵能力和对不良环境具有较高的抗性或耐受性。在酱香型白酒生产的过程中，随着微生物代谢，会形成温度高、酸度大和渗透压大的环境。在这种环境的长期驯化下，制酒环境中出现了一些具有良好发酵力并具有良好耐受性的酵母。曾从酱香高温大曲中分离出的耐高温卡斯特假丝酵母（Candida casterllani）在45℃时仍然具有较高的发酵性能，并且在不同环境中具有较强的耐受性[7]。从酱香型白酒堆积糟醅中筛选到一株耐高温酵母，其在45℃时生长良好并具有一定的发酵力和耐受性[20]。从酱香型白酒酒醅中分离的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce spombe）、Kazachstania exigua、白地霉（Geotrichum candidum）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）、Candida krusei这几种酵母具有发酵起始快、发酵能力强、对糖的利用能力高等特点，并且酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）展现出较强的酒精耐受性，而Kazachstania exigua展现出较强的耐酸性[11]。本课题组从酱香型白酒酒醅中筛选出两株产酒能力强的酵母，即东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）和粉状毕赤氏酵母（Pichia farinosa var.farinosa），其乙醇质量分数分别达69.13%和61.61%[3]。陈良强等[21]从酱香型白酒大曲和酒醅中筛选出的四株高产乙醇的酵母，其中栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）MT-14乙醇产生能力与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）以及参照菌株持平，但异丁醇和异戊醇产量明显偏低，且对高温、酸和乙醇等均具有较强的耐受性。该研究对降低酱香型白酒中杂醇油含量、提高酒质及发酵效率具有重要价值。可见从制酒环境中筛选的产酒酵母在生理生化特性上与制曲和制酒环境表现出一定适应性。

4.1.2 产香酵母的研究

传统认为非产酒酵母在白酒生产中地位较低，对白酒的生产意义不大。随着对这些酵母产香现象认识的加深，发现产香酵母能产生大量具有香味的醇、酸、酯类等物质，如苯乙醇、苯乙酸具有玫瑰风味，乙酸苯乙酯具有玫瑰花香、粉香、蜂蜜样香气，γ-癸内酯有类似椰子和桃子的香气，乙酸乙酯具有水果香味等。现在认为产香酵母产生的香味物质对白酒风味的形成贡献很大，因而研究酱香型白酒生产中的产香酵母十分必要。

茅台酒厂技术中心分离得到2株制酒发酵中产酒和产香主要的功能酵母，其固态发酵实验表明，这2株酵母能够产生多种香味物质[6]。本课题组从酱香型白酒酒醅中筛选出的平常假丝酵母（Candida inconspicua）和库德毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）表现出较强香味物质生产能力，其中以乙酸乙酯、异戊醇、乙酸苯乙酯产量较高[3]。东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）能够产生柠檬酸、酒石酸、苹果酸等有机酸类和大量的高级醇类物质，还能产生少量乙醛影响乙醇发酵[19]。卡斯特假丝酵母（Candida casterllani）除了能产生乙醇外，也能产生乙醛、乙酸乙酯、异丁醇等香味物质[7]。从酱香型习酒高温堆积糟醅中分离出的意大利酵母（Saccharomyces italicus）、地生酵母（Saccharomyces telluris）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和间型假丝酵母（Candida intermedia）不仅具有一定的发酵能力，其发酵液还呈现出不同程度酱香、酯香和醇甜香味，对其次生代谢产物进行分析表明，该4种酵母能产生多种酸、醇、酯等物质。此外，还发现葡萄糖和蛋氨酸能在意大利酵母（Saccharomyces italicus）酶促下发生美拉德反应，从而使得发酵液呈现出浓郁的芝麻香，该香味的主要成分为3-甲硫基-丙醇-1和5-羟基麦芽酚[13，22]。通过对膜璞毕赤酵母（Pichia membranifaciens）在不同环境下的代谢产物进行分析，表明该酵母主要产生酸、醇类以及少量特殊呈味物质，发酵产物中含有较为丰富的苯乙醇、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸等，还能产生降低胆固醇和血脂的功能性物质亚油酸乙酯[23]。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、Candida krusei、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）、拜耳结合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce spombe）、Kazachstania exigua、白地霉（Galactomyces geotrichum）均对高级醇、酸、酯、醛等风味成分的贡献很大[11]。茅台酒厂从酱香大曲中分离得到的白地霉（Geotrichum candidum）MTBD能产生酸类、酯类、醛酮类等多种成分，并与茅台酒风味成分相似性高[24]。此外，丝孢酵母属（Trichosporon）、汉逊酵母属（Hansenula）和假丝酵母属（Candida）的酵母菌均具有一定的产香能力。关于产香酵母的研究一直在进行，随着研究的深入，不仅能为酱香型白酒风味形成机理提供参考，亦为利用产香酵母来改善和强化白酒风味提供了理论支撑。

4.2 其他功能的研究

酱香型白酒发酵过程不是单菌作用过程，而是多菌参与、混合发酵的结果，因而仅仅是从酵母的角度来研究酵母的功能及作用并不全面。相应地，混菌发酵研究能从其他角度来说明酵母在白酒发酵中的作用，因而亦是当今研究的热点。目前，研究发现酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）与米曲霉（Aspergillus oryzae）XJ10混菌发酵时，适当条件下，能够显著提高乙醇产量、酵母生物量以及酯类、酸类、醇类、醛酮类等风味物质的浓度，特别是对白酒风味具有重要作用的苯乙酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸、3-甲基-丁醇等化合物的浓度[25]。其他研究还发现酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）与异常毕赤酵母（Pichia anomala）混菌发酵时，能够产生更多的酯类物质，降低了发酵液中高级醇和总酸的含量，有效地改善了发酵液的风味[26]。这些研究不仅为传统固态发酵生产酱香型白酒中微生物代谢研究提供了科学依据，也对指导实际生产具有重要作用。此外，本课题组从酱香型白酒大曲和酒醅中筛选到一株能在丢糟中大量繁殖的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），在适当条件下，能将固态白酒丢糟有效转化为高蛋白饲料和酵母菌剂，既能实现资源的充分利用，也提高了酵母的经济学价值[27]。

4.3 功能酵母的应用

如何将功能酵母应用来提高出酒率和丰满酒体风格一直是企业技术人员和科研人员的研究热点。茅台酒厂技术中心将老车间成熟堆醅投入到新制酒车间的堆子和窖池中，改善了新车间中5种功能菌株（包括两种酵母和3种芽孢细菌）分布异常的情况，明显提高了轮次酒的质量[6]。马荣山等[28]从麸曲酱香型白酒酒醅中分离得到7株酵母菌，通过制曲筛选出5株酶活力高、发酵力强的酵母菌，将其作为酒曲发酵菌种，生产出的酒的酱香味突出，酒体清亮透明，绵甜醇厚，具有明显的酱香风格。将酱香型酒堆积糟醅中的优势酵母应用到实际生产中，所产酒酯香味突出，醇甜味要比标准酒样显著[29]。以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和米曲霉（Aspergillus oryzae）XJ10制作麸曲投入实际生产发酵，在适当比例之下，能够在保留好的风味和口感的前提下明显提高出酒率，增加了生产效益[25]。本课题组拟将分离得到的一株既产酒又产香的酵母应用到酱香型白酒生产中，旨在探究该酵母是否能够对生产工艺进行强化，经济学价值如何。可见将功能酵母投入实际生产取得了一些可喜的成果，但仅仅通过向酱香型白酒生产工艺中加入功能酵母来对工艺进行强化容易造成调控的盲目性，不一定能达到预期的效果。随着对酵母功能和特性、相互作用机制的深入研究，相信如何最大程度地利用这些功能酵母会形成一套特殊的理论，来科学地指导实际生产。

5 酱香型白酒酿造体系中酵母分析技术的研究

纯培养技术是传统的分析方法，广泛用于企业和科研单位初期样品微生物的分离、计数以及功能微生物的筛选。采用平板分离法对样品中酵母进行培养，通过形态特征及其生理生化特性以及分子特性等来对酵母进行鉴定，结合计数结果来分析酵母在酱香型白酒生产中的分布情况、消长规律以及多样性等，并在酱香型白酒的研究中取得了较多的成果。

生长环境的复杂性以及培养条件的限制，使得样品中只有1%的微生物可培养，因而纯培养技术不能对样品酵母群落结构做出完整地分析。直接以样品内全部微生物为研究对象的免培养群落分析技术得到了迅速发展，为完整而客观地分析样品中酵母结构提供了可能。目前用于白酒微生物研究的免培养技术有BIOLOG ECO微平板技术、磷脂脂肪酸谱和一些分子生物学技术，如扩增核糖体DNA限制性分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDAR）、限制性片段长度多态性分析（restrictionfragment length polymorphism，RFLP）、变性梯度凝胶电泳、单链构象多态性技术（single-strand conformation polymorphism，SSCP）、随机扩增多态性DNA标记技术（random amplifiedpolymorphim DNA，RAPD）、荧光定量PCR技术等[30]。利用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术对酱香型白酒酒醅中酵母群落结构进行分析表明，酒醅中酵母种类丰富，优势酵母种类以及窖池中酵母群落结构的稳定性随发酵轮次而异。并对通过对各轮次酵母种类和生物量、乙醇产量以及酒醅中挥发性化合物的差异分析阐述了酵母菌群结构变化对酱香型白酒风味组分的影响[18]。对酱香型郎酒大曲中酵母的DGGE指纹图谱的分析表明，酱香型郎酒高温大曲中仍然存在多种酵母，不同工艺大曲酵母多样性和大曲制曲温度并没有呈一定的相关性[10]。采用克隆文库技术与聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术相结合的手段，分析不同香型大曲微生物群落组成，发现酱香型郎酒大曲中Trichomonascus ciferrii是主要的酵母[4]。

以上免培养技术受到微生物数量、反应条件等因素的影响，在一定程度上限制了对样品微生物的全面认识。随着第二代高通量测序技术的出现和发展，大规模测序成为可能，能够对样品中微生物群落结构做出更加快速和准确地分析，并在白酒微生物的研究中逐渐成为研究热点。如黄祖新[31]早前便对将宏基因组技术应用到白酒大曲微生物的研究中进行了论述，提出宏基因组技术在挖掘大曲中微生物资源、基因资源、酶资源，以及全面探究不同大曲酒微生物群落多样性及其变化规律的可能性，进而对全面了解大曲中微生物代谢机制及破解酱香型白酒香味组成物质提供理论支撑。目前，应用宏基因组技术来研究酱香型白酒中细菌群落结构的研究已有报道，但是对酵母群落结构的研究仍然空缺。

6 总结

综述酱香型白酒制曲和酿造过程中酵母动态变化规律，对控制酱香型白酒生产以及工艺的稳定性和规范性具有指导意义；研究酵母的功能对控制白酒质量具有重要作用，并在一定程度上能够利用功能酵母来对酱香型白酒生产工艺进行强化，提高酒质；对技术的研究，为酿造过程中酵母组成和变化形成完整而系统的分析提供了可能。随着研究的深入以及技术的发展，酱香型白酒的发酵机理将得到更加合理的解释。

[1]蒋红军.茅台酒制曲发酵过程中微生物演替及作用规律[J].酿酒科技，2004（3）：39-40.

[2]陶菡，陈孟强，邹江鹏，等.现代科技在酱香型白酒研究与生产中的应用[J].酿酒科技，2014（9）：81-87.

[3]庞博.酱香型大曲酒酿造过程酵母微生态及功能菌株筛选[D].贵阳：贵州大学硕士论文，2014.

[4]王彩虹.基于克隆文库法研究不同香型大曲微生物群落结构[D].自贡：四川理工学院硕士论文，2014.

[5]汤有宏，李红歌，李晓欢.基于Biolog ECO技术对贮存过程中大曲微生物多样性变化规律的研究[J].酿酒，2015（1）：75-78.

[6]范光先，王和玉，崔同弼，等.茅台酒生产过程中的微生物研究进展[J].酿酒科技，2006（10）：75-77.

[7]赵爽，杨春霞，窦屾，等.白酒生产中酿酒微生物研究进展[J].中国酿造，2012（4）：5-10.

[8]高亦豹.聚合酶链式反应-变性梯度电泳技术（PCR-DGGE）研究中国白酒大曲中微生物群落结构[D].无锡：江南大学硕士论文，2010.

[9]孔维兵，王晓丹，班世栋，等.酱香型大曲中酵母的分离与鉴定[J].酿酒，2015（1）：57-62.

[10]吴徐建.酱香型白酒固态发酵过程中酵母与细菌群落结构变化规律的研究[D].无锡：江南大学硕士论文，2013.

[11]黄永光，谌永前，吴广黔，等.酱香白酒堆积发酵过程酒醅中酵母菌的分析研究[J].酿酒科技，2013（6）：8-13.

[12]唐玉明，任道群，姚万春，等.酱香型酒糟醅堆积过程温度和微生物区系变化及其规律性[J].酿酒科技，2007（5）：54-58.

[13]庄名扬，孙达孟.酱香型白酒高温堆积糟醅中酵母菌分离、选育及其分类学鉴定[J].酿酒，2003（2）：12-13.

[14]余婷婷，赖世强，曹文涛，等.酱香型白酒高温堆积糟醅中耐高温酵母的筛选及鉴定[J].酿酒科技，2014（6）：24-26.

[15]冯雨.酱香型白酒的堆积发酵[J].酿酒科技，2013（2）：80-81.

[16]唐玉明，姚万春，任道群，等.酱香型白酒窖内发酵过程中糟醅的微生物分析[J].酿酒科技，2007（12）：50-53.

[17]胡峰，钟方达，胡建锋，等.酱香型白酒窖内不同层次酒醅微生物与酒体风格的研究[J].酿酒科技，2014（9）：48-52.

[18]邵明凯，王海燕，徐岩，等.酱香型白酒发酵中酵母群落结构及其对风味组分的影响[J].微生物学通报，2014（12）：2466-2473.

[19]孙剑秋，刘雯雯，臧威，等.基于26S rDNA D1/D2序列分析酱香型白酒酒醅中酵母菌的群落结构[J].微生物学报，2012（10）：1290-1296.

[20]徐超英，赖世强，徐厚禄，等.酱香型白酒糟醅中耐高温酵母菌的特性研究[J].酿酒科技，2012（8）：38-40.

[21]陈良强，吴群，徐岩.酱香型白酒低产杂醇油粟酒裂殖酵母特性的研究[J].工业微生物，2013（3）：1-6.

[22]杨国华，邱树毅，黄永光.酱香白酒生产中产香微生物研究[J].中国酿造，2011，30（4）：24-27.

[23]姚翠萍，王和玉，林琳，等.一株膜璞毕赤酵母的生理特性及其代谢产物研究[J].酿酒科技，2011（7）：57-59.

[24]张应莲，黄永光.酱香大曲中Geotrichum candidum MTBD菌株筛选及发酵产物研究[J].酿酒科技，2012（12）：31-33，36.

[25]陈笔.酱香型白酒酿造过程中霉菌群落结构以及霉菌与酵母相互作用的研究[D].无锡：江南大学硕士论文，2014.

[26]唐洁，王海燕，徐岩.酿酒酵母和异常毕赤酵母混菌发酵对白酒液态发酵效率和风味物质的影响[J].微生物学通报，2012（7）：921-930.

[27]庞博，王晓丹，彭正东，等.一株生产固态白酒丢糟菌体饲料的酵母菌筛选[J].酿酒科技，2013（9）：30-33.

[28]马荣山，刘婷，郭威.麸曲酱香酒醅中酵母菌的分离、筛选及应用[J].中国酿造，2008，27（1）：17-18.

[29]刘涛，赖世强，曹文涛，等.酱香型白酒堆积发酵中两株优势酵母菌发酵条件的研究[J].酿酒科技，2014（9）：5-8.

[30]杜礼泉，罗惠波，黄治国，等.微生物群落相关技术在窖泥微生物研究中的应用[J].酿酒，2014（4）：42-49.

[31]黄祖新.宏基因组技术在酱香型白酒酒曲功能微生物研究[J].酿酒科技，2009（10）：17-21.

Research progress of yeast in Moutai-flavor liquor production

CHEN Meizhu1,3,QIU Shuyi1,2,HU Baodong1,2,WANG Jing1,2,XU Jia1,2,WANG Xiaodan1,2,3*
(1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 3.College of Life Sciences,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

This paper reviewed the research progress of the diversity,growth and decline rules,functions and applications of yeast in Moutai-flavor liquor production from Daqu making-process,stacking-process of fermenting grains to the fermentation process in pits.Besides,the relevant technologies in yeast analysis in Moutai-flavor liquor production were also introduced.Cognizing the yeast during the production process of Moutai-flavor liquor with multiple perspectives was not only referential to reveal the fermentation mechanism of Moutai-flavor liquor and improve the quality of the liquor,but also had directive significance to control the stability and normalization of the production technology.

yeast;growth and decline rules;diversity;function;application;analysis technology

TS 262.3

A

0254-5071（2015）06-0005-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.002

2015-05-17

贵州省科技厅重点攻关项目（黔科合GZ字[2014]3012）；贵州省科技厅重大专项项目（黔科合重大专项字[2013]6009号）；科技部科技支撑计划项目课题（2011BAC06B12）；贵州省科技厅联合资金项目（黔科合LH字[2014]7672）

陈美竹（1991-），女，硕士研究生，研究方向为应用微生物学。

*通讯作者：王晓丹（1980-），女，工程师，博士研究生，研究方向为应用生物技术。