鸡球虫病的免疫预防研究进展

康桂英

（内蒙古民族大学动物科学技术学院,内蒙古通辽 028000）

鸡球虫病的免疫预防研究进展

康桂英

（内蒙古民族大学动物科学技术学院,内蒙古通辽 028000）

鸡球虫病是由一种或多种球虫引起，对养鸡业危害比较严重的肠道寄生虫病。该病多发于15～50日龄的雏鸡，发病率与死亡率都极高。成年鸡多为带虫者，对其生产能力有一定的影响。据报道，英国每年由于鸡球虫病造成的损失约为4 200万英镑；美国每年由于鸡球虫病造成的直接或间接经济损失高达20～30亿美元。目前，该病已被美国列为对禽类危害最严重的五大传染病之一。随着球虫病的药物防治成本不断提高、药物残留问题和耐药虫株的出现，研究者们将防治鸡球虫病的重点由药物防治逐渐转移到免疫预防，用疫苗免疫球虫病将成为球虫病防治的发展趋势，人们所用的疫苗有强毒苗，弱毒苗、基因工程苗和单克隆抗体。

1 强毒苗

强毒苗就是指利用自然界分离的强毒虫株制备的疫苗。常用的制备方法是收集自然发生鸡球虫病的病鸡粪便中的混合卵囊，然后，再用单卵囊分离法把不同种类的艾美耳球虫分离出来并增殖，加入适当的稳定剂，然后再按一定的比例混合制成强毒活苗。或在收集卵囊以后，不分离卵囊，而是使用混合卵囊来制备强毒虫苗。目前，世界上的鸡球虫强毒疫苗有美国生产的“Coccivac”，加拿大的“Immucox”。我国也有一些教学和科研单位研究出强毒疫苗，其效果与进口疫苗相仿。中国农业大学寄生虫研究组曾用由5种鸡艾美耳球虫和悬浮剂制成的疫苗对肉仔鸡进行免疫接种，结果显示接种后鸡无不良反应，接种6周后能抵抗20万混合孢子化卵囊的攻击。陈明勇[1]用幼嫩艾美耳球虫强毒苗长期低水平的免疫鸡后，鸡体能产生一定的免疫保护。

鸡在低剂量感染强毒苗时不会出现病理现象，但是，卵囊会留在鸡体内进行生长繁殖，并且伴有新的卵囊排出体外，排出体外的卵囊混合在鸡的生活环境中，鸡再接触时又一次感染，通过这样的几次感染免疫后，鸡就能够得到较好的免疫保护。尽管强毒苗能诱使鸡发生免疫应答从而产生免疫保护，但由于强毒苗的毒性较强，所以，容易引发鸡群发生鸡球虫病。其次，由于接种疫苗，有可能给没有球虫病的鸡群带来强毒的球虫，引发球虫病。由于以上这些缺点，人们又开始把研究目标放在了弱毒苗上。

2 弱毒苗

制备弱毒苗采用毒性致弱的卵囊。自然界能分离到弱毒虫株的情况尚未见到报道，一般都是通过人工方法使毒株的毒力减弱，使其对宿主的危害降低，但是，能使宿主产生足够的免疫力从而达到免疫的效果。目前，人工制备弱毒苗的方法有：鸡胚传代致弱、早熟选育、理化处理及细胞培养等。

2.1 鸡胚传代致弱

用鸡胚培养球虫子孢子，球虫子孢子在鸡胚尿囊膜上连续生长几代后，其致病力下降，但其免疫原性不变，用这样的球虫制备疫苗称之为鸡胚传代致弱虫苗。Long等[2]首次用柔嫩艾美耳球虫培养出鸡胚致弱虫株，其致病力低于亲本株，同时也能使宿主产生免疫，抵抗强毒的攻击。鸡胚传代致弱疫苗的免疫力也相对较稳定，例如，樊生超等[3]将柔嫩艾美耳球虫鸡胚适应株连续回鸡6代仍然没有返祖现象，致病性依旧较低，没有威胁。樊玉娟[4]在对柔嫩艾美耳球虫的生物学特性研究发现，致弱后的卵囊在致病力、繁殖能力较原始株有所减弱，免疫原性保持良好。但球虫的免疫原性会受传代次数的影响，传代次数增多，球虫的免疫原性会减弱甚至消失，而且鸡胚适应株回归鸡连续传代一定次数后，有可能出现致病性恢复的现象。此外，巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和早熟艾美耳球虫不能使用鸡胚传代方法致弱。

2.2 早熟选育

早熟选育筛选虫苗的过程是将自然界分离的虫株通过鸡体连续传代，筛选出早熟虫株。致弱虫株与亲代相比，生活史周期大大缩短，产出的卵囊量也减少了，致病力降低，但是免疫原性仍然保持良好。McDonald等[5]研制的巨型艾美耳球虫早熟系，潜伏期从120 h减少到107 h，致病能力和繁殖能力都比亲本代有所降低；史宗勇等[6]对毒害艾美耳球虫早熟株的致病性和繁殖力进行测定，测定结果显示裂殖阶段裂殖次数减少，时间缩短，裂殖子数量减少，从而导致繁殖能力下降，继而致病力降低。段家树等[7]采用早熟选育的方法，成功研制了单价柔嫩艾美耳球虫弱毒。国内外研究者应用这种选育方法已经成功研制出了柔嫩艾美耳球虫，堆型艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫的早熟苗，其致病力低，免疫原性和亲代相仿。研究者们通过实验证实所有球虫都可以通过这种方法来致弱。

2.3 理化处理

就是通过物理和化学方法对球虫卵囊进行处理，使其致病力降低。常用的方法有冷冻、加热、辐射，化学诱变剂等。吴兆敏等[8]证明了用化学诱导剂NTG处理后的柔嫩艾美耳球虫免疫小鸡后，雏鸡可以获得保护性免疫，球虫毒力下降的同时其繁殖能力也有所下降。很多人怀疑辐射致弱并不是真的致弱，而是减少了活卵囊的数量。Jenkins等[9]经过免疫组化研究证明，卵囊被辐射减毒致弱后，卵囊的裂殖阶段停止，没有继续发育。这个研究结果否定了人们对辐射致弱的本质的怀疑。

2.4 细胞培养

Zhang等[10]将柔嫩艾美耳球虫用鸡肾细胞培养，球虫经过鸡肾细胞与鸡体交替传代14代以后，将原代球虫F0和第14代球虫F14分别免疫试验鸡，结果显示，两种球虫都能使鸡体产生免疫反应，F14的致病性和死亡率都有所降低。其主要原因是由于F1～F14与F0代相比出现了一些质的变化，这个变化是多个卵囊可以同时寄生在一个原代鸡肾细胞内。在多重感染的细胞周围，人们还发现了一些正常的细胞，这表明不同的宿主细胞对裂殖子的易感性不同。

3 基因工程苗

致弱虫株制备出的活苗多次接种回归鸡体后会不会出现返祖现象，这是一个令人担忧的问题，所以研究者开始关注基因工程疫苗。

3.1 重组蛋白疫苗

将鸡球虫的抗原基因与表达载体重组，将重组子转入细菌或细胞中进行高效表达，收集并纯化表达的球虫抗原蛋白，利用这些蛋白制备的疫苗即重组蛋白疫苗。徐占云等[11]截取了柔嫩艾美耳球虫的一部分抗原基因λMzp5-7，使其与载体重组后将其在大肠杆菌中表达形成重组抗原。将重组抗原免疫雏鸡，实验结果显示柔嫩艾美耳球虫λMzp5-7的重组抗原能使雏鸡产生免疫应答反应。彭昊等[12]在对巨型艾美耳球虫重组蛋白Gam82-Y的免疫原性研究实验中指出，Gam82-Y重组抗原能减少卵囊的排除，具有一定的免疫作用。李安兴等[13]成功克隆出柔嫩艾美耳球虫北京株重要抗原SO7基因，并在大肠杆菌中表达，用该重组抗原免疫鸡后，鸡能得到部分保护力。潘晓婷等[14]用柔嫩艾美耳球虫BJ株的EtMIC和ta4两种基因的表达产物免疫鸡后，用柔嫩艾美耳球虫攻击免疫后的鸡，结果发现免疫鸡对柔嫩艾美耳球虫具有一定的免疫力。

3.2 核酸疫苗

核酸疫苗也称基因疫苗，就是将鸡球虫保护性抗原基因克隆到质粒载体中，然后导入宿主体内，利用宿主的表达系统表达抗原蛋白，宿主细胞产生对该蛋白的免疫应答。例如Song K D等[15]将柔嫩艾美耳球虫的3-1EcDNA基因克隆到质粒pBK-CMV中，形成一个表达性的质粒载体Pmp-13，对一日龄的鸡进行皮下注射或者肌肉注射免疫，攻毒后卵囊产出减少，结果表明能产生一定的免疫力。李文超等[16]使用其构建的柔嫩艾美耳球虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因核酸疫苗对雏鸡进行了免疫，通过结果显示该核酸疫苗对鸡柔嫩艾美耳球虫感染具有一定的保护作用。大量实验证明，核酸疫苗能激发机体产生剧烈的CTL反应，而鸡球虫免疫主要以细胞免疫为主，所以核酸疫苗在球虫免疫方面有很大的优势。吴绍强[17]使用MTT法进行淋巴细胞转化实验来检测PCT核酸疫苗的细胞免疫水平，结果发现，核酸疫苗PCT能很好地诱导机体产生细胞免疫反应。

3.3 活载体疫苗

在鸡的保护性免疫中，免疫细胞，尤其是T淋巴细胞，巨噬细胞和NK细胞起着重要的作用，所以，常采用合适的载体研制活载体疫苗，这样可以模拟抗原在鸡体内的递增过程，从而诱导细胞产生免疫应答，同时提高疫苗的保护能力。已用做鸡球虫活载体疫苗的载体有禽痘病毒、鼠伤寒沙门氏菌和火鸡疱疹病毒等。杜爱芳等[18]使用减毒沙门氏菌为载体传递鸡球虫DNA疫苗的实验结果也证明了携带柔嫩艾美耳球虫5401基因的重组菌能诱导机体产生抗体，也能显著增强淋巴细胞的增殖水平。用鼠伤寒沙门氏菌重组的抗原，经口免疫能延长抗原在鸡体内肠道中的作用时间；用禽痘病毒和火鸡疱疹病毒重组的抗原，能诱导部分细胞和体液的免疫反应。

4 单克隆抗体

自单克隆抗体被成功的制备出来，这项技术就发挥了重要的作用，成为疾病诊断、治疗、预防领域中不可或缺的一项技术。国内已建立起培育针对堆型艾美耳球虫的单克隆细胞株。在国内，王承民等[19]利用杂交瘤技术，将堆型艾美耳球虫的子孢子可溶性抗原免疫的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合，再通过间接ELISA方法筛选，得到能产生能对堆型艾美耳球虫子孢子特异性抗体的细胞株5B4和5G7。单克隆技术效果很明显，但是还存在很多问题。虽然单克隆抗体的特异性很强，但是它在体内代谢迅速，数量过少则不能发挥其免疫特异性，有时部分抗体在体内不能完全发挥其凝集活性。此外，制备单克隆抗体的技术很烦琐又费时间，筛选的抗体只能保持天然抗体的活性，有些优良抗体基因很容易在传代中丢失。在制备单克隆抗体时我们要结合基因工程，来弥补在杂交瘤细胞技术和本质上的不足，使单克隆抗体技术更加完善。

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康桂英（1976-），女，内蒙古凉城人，硕士，主要从事寄生虫及寄生虫病的研究。

项目来源：内蒙古民族大学科学研究基金资助项目（项目编号：NMD1215）