Notch1在心血管疾病中的研究现状

Notch1在心血管疾病中的研究现状

马建赢唐燕华

(南昌大学第二附属医院心胸外科，江西南昌333000)

关键词〔〕Notch1；动脉粥样硬化；先天性心脏病；心脏干细胞

中图分类号〔〕R541〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金(No.81160019)

通讯作者：唐燕华(1965-)，女，主任医师，博士生导师，主要从事心脏病研究。

第一作者：马建赢(1986-)，男，硕士，主要从事先天性心脏病与基因关系的研究。

心脏发育是一个极其复杂的过程，需要各种信号通路调节基因时间和空间的精确表达，常见的与心脏发育相关的信号通路包括骨形态发生蛋白(BMP)，Wnt /Wingless，转化生长因子(TGF)及Notch信号通路等。国内外实验研究提示Notch信号介导的细胞间通讯在心血管发育过程中起着非常关键的作用，而对于Notch同源分子之一的Notch1研究较少，现就 Notch1在心血管疾病研究现状进行综述。

1Notch信号通路

1.1Notch信号通路的组成1917年，Morgan及其同事在突变的果蝇中发现一种基因，该基因的部分功能缺失会使果蝇翅膀边缘出现缺刻，随后研究发现Notch在脊椎动物中也有表达，并在细胞分化、发育中起着关键作用。

1.2Notch信号通路的生化机制Notch信号转导不需要第二信使和蛋白激酶的参与，可直接接收邻近细胞的信号并传到细胞核，激活相关转录因子的表达。配体与受体的结合导致受体产生两次蛋白裂解是Notch信号通路的主要机制。第一次蛋白裂解由金属蛋白酶(ADAM)家族成员之一的肿瘤坏死因子α转化酶介导〔1〕，第二次裂解由包括早老素在内的蛋白分泌酶复合体来完成。经过上诉酶切过程，形成了可溶性的Notch胞内段的活化形式(NICD)并转移到核内与初级转录因子CSL结合〔2，3〕。NICD与CSL结合并募集共活化物，如MAml和维生素D受体共激活因子ski相互作用蛋白(SKIP)，MAml动员组蛋白乙酰基转移酶P300并诱导转录起始和延伸复合物的装合物的装配。缺乏Notch信号通路，CSL则与共抑制受体SMRT、MINT/SPEN、CtBP、组蛋白去乙酰化酶结合后抑制Notch靶基因的启动，最终影响细胞的分化、增殖和凋亡〔4，5〕。除了CSL经典通路外，最近有发现非CSL依赖的Notch信号通路，它涉及到丝氨酸/苏氨酸激酶特异性蛋白激酶(AKT)的激活，转录因子Stat3的磷酰化，Sonic和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的激活，具体机制尚不清楚〔6〕。Notch信号转导通路的调节是多层面的，包括配体-受体的表达，配体受体的相互作用和运输以及共价性修饰(糖基化、磷酸化和泛素化)，部分泛素化途径的Notch蛋白质具有保守性的区域，并且Notch胞内结构域的泛素最近被发现是可以降解的，Notch途径的蛋白水解的异型衍生物也确定可能涉及到替代性的Notch途径或者调节机制〔7〕。

2Notch1与心血管疾病的关系

2.1Notch1与瓣膜疾病的关系上皮间质转化(EMT)是胚胎发育的基础，所谓EMT就是紧密的上皮细胞失去之前的细胞形态，形成一种新的间质细胞类型。心脏瓣膜的形成恰好是EMT转化的一个比较好的例子，它也是心脏瓣膜发育的一个必经过程。心脏瓣膜位于房室管和流出道的组织，在房室管的EMT发育成二尖瓣和三尖瓣，在流出道的EMT则发育成主动脉瓣和肺动脉瓣膜。心脏瓣膜的形成是多种因素共同调节形成的，比如Wnt、骨形态发生蛋白(Bmp)、Notch等，目前普遍认为Notch、Wnt 和Bmp都参与EMT过程。Wang等〔8〕发现Notch1-jagged1信号通路在小鼠心脏EMT以及早期心脏瓣膜形成过程中起到决定性的作用，从分子水平上证实敲除Notch1或jagged1的小鼠胚胎引发EMT形成中关键性基因的表达减少，包括转录因子Hey1、Snai1、Snai2、Msx1和Msx2，同时在一定程度上证明了Notch，Wnt 和Bmp 信号通路相互关联性的参与EMT过程。综上可推测Notch1的突变将影响EMT的形成从而引起瓣膜疾病。主动脉瓣疾病是一个比较常见的瓣膜病变，钙化瓣膜可导致狭窄或者反流。Acharya等〔9〕研究证实在人的钙化主动脉瓣膜中激活的Notch1明显减少，这个钙化的过程伴随着EMT的裂解。至于突变Notch1导致主动脉瓣钙化的原因，有很多机制，Acharya等〔9〕认为Notch1突变引起Sox9表达的下调，Sox9是一种可以调节EMT基因表达的关键性转录因子，同时它亦是正常瓣膜形成所必须的，Sox9表达的下调导致主动脉瓣钙化的发生。Zeng等〔10〕发现Notch1水平的升高和不断激活可以调节细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)、核转录因子kappa B(NF-κB)的活性从而造成主动脉瓣间质细胞的钙化反应。总之Notch1导致瓣膜病变的机制尚待进一步研究。

2.2Notch1与动脉粥样硬化(AS)的关系AS是一种炎症性疾病，是具有慢性炎症反应特征的病理过程。这种炎症过程源于血浆脂蛋白、细胞组分(单核/巨噬细胞、T淋巴细胞、内皮细胞和平滑肌细胞)与动脉壁细胞外基质间的相互作用。病理变化主要累及体循环系统的大型肌弹力型动脉(如主动脉)和中型肌弹力型动脉(以冠状动脉和脑动脉)。巨噬细胞在 AS起始发展的全过程中扮演着重要角色。巨噬细胞脂质化后形成泡沫细胞是粥样硬化发生的始动因素。但是巨噬细胞中Notch1信号通路调控介导AS发生、发展的机制仍然不是十分明确。Notch1在巨噬细胞分化过程中可以促进M1型巨噬细胞的激活和细胞因子的释放引起炎症反应，导致AS，干扰Notch1信号通路则可明显促进抗炎症型M2型巨噬细胞的产生以及上调抗炎症细胞因子的分泌〔11〕。血管内皮细胞也是Notch1信号通路作用的一个靶点，Liu等〔12〕发现Notch1可抑制内皮细胞的生长引起内皮细胞衰亡，而且notch1信号通路可以正反馈调节内皮细胞炎症因子的表达，如白细胞介素6(IL-6)，IL-8，IL-1α，细胞间黏附分子-1(ICAM-1)等，这些机制最终都潜在性参与了AS的发生、发展。此外，淋巴细胞也被发现与AS的发生密切相关。T细胞的活化需要输入信号和外部信号的整合，二者通过T细胞表面受体介导的NF-κB来形成CBM(由支架蛋白CARMA1、衔接蛋白BCL10和Paracaspase酶MALT1组成)复合物。细胞质中的Notch1在早期通过激活NF-κB起到分子支架的作用，晚期则促进NF-κB基因的转录，故notch1对于T细胞的活化起到重要的作用〔13〕。Del Papa等〔14〕发现体外实验中CD4+T细胞与间充质干细胞(MSCs)同时培养时Notch1通路是活化状态的，通过γ分泌酶抑制剂(GSI-I)或者 Notch1中和抗体来抑制Notch1信号通路，则Notch1信号下游的靶基因表达MSC诱导的CD4+CD25FOXP3+细胞百分比减少，实验还表明FOXP3是Notch1信号通路下游的靶基因，并提示notch1信号通路的激活是人类MSC介导的调节性T细胞形成的新型机制。调节性T细胞具有两种特征即免疫抑制性及免疫无反应性，它通过以下两个方面来抑制炎症反应延缓AS：(1)调节性T细胞可以促进M1型巨噬细胞向抗炎性M2型巨噬细胞转化。(2)调节性T细胞可以下调清道夫受体 SR-A 和 CD36来抑制脂质的沉积，最终阻碍巨噬细胞向泡沫细胞的转化，而泡沫细胞的形成是AS最具有特征性的事件〔15〕。Notch1除了诱导产生调节性T细胞抑制AS的进展，它同期诱导产生的T细胞可以促进或者加重AS。 Zhou等〔16〕将有免疫缺陷的和有AS倾向的载脂蛋白E(Apoe-/-)小鼠进行杂交，其后代动脉脂肪纹损害的程度较正常免疫的小鼠下降73%，将CD4+T淋巴细胞从Apoe-/-转移到有免疫缺陷的Apoe-/-损伤增加164%，说明CD4+T淋巴细胞能促进AS的形成。表达 CD41Th2的白变种实验室老鼠(BALB/c)老鼠不易发生AS，而表达CD41Th1的老鼠倾向于发生AS，给予这两种老鼠喂养高胆固醇饲料16 w后发现，通过抗体a-CD4或IL-4来减少Th1 cells可以使AS损害下降了80%，而Th2剔除的BALB/c 老鼠与CD41Th1老鼠发生AS的概率相当，这提示Th2对于AS的发生发展或许作用更大〔17〕。综上所述，Notch1对于T细胞分化的调控最终可能导致AS的发生，若发生在冠状动脉，则可引起冠心病，若发生在外周动脉，则可能引起高血压等心血管疾病。

2.3Notch1与先天性心脏病(CHD)的关系

2.3.1CHD是指胚胎时心血管发育异常所致的心脏血管形态、结构、功能、代谢的异常。它的发病率高，危害性大，也是婴幼儿死亡的主要原因。到目前为止CHD的病因仍然不是十分明确，但是认为它是由环境和遗传两个关键因素造成的。环境因素主要为母亲妊娠期疾病，宫内感染及服用药物和高温、辐射暴露等因素。遗传因素包括单基因、多基因、染色体等。由染色体畸形导致的疾病包括21三体综合征、猫叫综合征等，引起先天性心脏病的单基因有GATA4、NKX2-5、TBX5、notch。

2.3.2Notch1与CHD研究表明，在小鼠胚胎8.5 w，靠近心内膜的心肌细胞更多的表达Notch1，而远离心内膜的组织较少表达Notch1。胚胎9.5 w，心房心内膜表达Notch1，心室肌骨小梁在发育过程中不对称性表达Notch1，到11.5 w时，左、右心室的骨小梁高度表达Notch1，13.5 w时心房壁开始表达Notch1〔18〕。Notch1对于心脏心室腔和骨小梁生长十分关键。骨小梁逐渐发展为室间隔、心脏传导组织以及乳突肌的一部分。任何影响骨小梁的因素都最终可能导致先天性心脏病。Grego-Bessa等〔19〕发现Notch1和RBPJk的突变导致骨小梁形成受损，减弱Eph受体相互作用蛋白B2(EphrinB2)，NRG1(Neuregulin-1)和BMP10的表达以及抑制心肌的增长，并且认为在骨小梁的分化中Notch1独立的调节心肌心包的增长和分化，这其中主要包括两个过程，其一是原始心肌内皮细胞向骨小梁和致密心肌的转化，另外一个是在上述转化过程中增值性骨小梁心肌细胞数目的保持。Notch1调节过程的紊乱都可以导致先天性心脏病的发生。

先天性主动脉瓣狭窄、主动脉缩窄和左心室发育不良综合征都是与左室流出道有关的先天性畸形。McBride等〔20〕发现在左室流出道缺陷的病人中发现了Notch1突变，而且Notch1突变减少了Notch信号通路中配体jagged1的数量以及干扰Notch配体S1的分裂，其中的分子机制以及相关信号通路如何导致左室流出道的缺陷仍然不清楚。心脏右心室流出道形成中，血管内皮生长因子和Notch的作用逐渐被认可，van den Akker等〔21〕用免疫组化的方法发现胚胎老鼠心脏右心室流出道的异常突变的血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR-2)，Notch1以及Jagged2，并推测它们的异常会导致心内膜垫和心肌的缺陷，并最终可导致CHD，比如法洛四联症。

2.3.3Notch1与心律失常的关系心脏正常激动起源于窦房结，沿着传导系统下传，依次传入心房和心室，使心脏发生收缩和舒张反应。如果窦房结激动异常或激动起源于窦房结以外，激动的传导缓慢、阻滞或经异常通道传导，就会产生心律失常。至于心律失常的机制有很多，目前普遍认为离子通道和离子通道调控蛋白突变是心律失常的主要病因，包括长QT综合征、Brugada综合征(BS)、儿茶酚胺诱导的多形室性心动过速，心房颤动。已有多个离子通道基因被证明与心律失常的形成相关，包括SCN5A、KCNQ1、KCNE1、KC-NE2、HERG、KCNJ2等。Rentschler等〔22〕研究发现小鼠心肌生长过程中表达活化形式的Notch1 则会产生心室预激，心肌激活的Notch信号可以产生渗透性的附加径路和心室预激。相反，抑制心肌Notch信号可使房室结发育不良，即特异性丧失表达连接蛋白30.2的慢传导细胞(Cx30.2)和生理性房室传导延迟的丧失，结果表明在心肌传导组织形成过程中，Notch调节AV通路胚胎心肌细胞的功能性成熟。随着研究的深入，越来越多的基因被发现，机制也将进一步被阐明，将为指导临床诊断和治疗提供更好的线索〔22〕。

2.3.4Notch1与心肌病的关系除了上述心血管疾病与Notch1存在一定的关联外，目前还发现了Notch1与心肌病有一定关系。心脏干细胞(CSCs)是一种自我更新的多功能细胞，可以分化为心肌细胞、平滑肌细胞或者内皮细胞。Notch1信号通路对于CSCs的生长以及分化非常重要。CSCs表达Notch1配体以及位于细胞核内活化形式的Notch片段(N1ICD)，N1ICD的过度表达可以显著扩增肌细胞的数目。在新生小鼠体内使用 γ-secretase 抑制剂阻断Notch通路，增加了扩张性心肌病的发生率以及高死亡率〔23〕。 Collesi等〔24〕发现体内或体外实验的未成熟心肌在增生过程中都表达Notch1，而且激活的Notch1在心脏的数量随着时间会逐渐减少，抑制Notch通路会妨碍心肌的增生并引起心肌坏死。也有一些研究认为Notch1与肥厚性心肌病有联系，但是仍缺乏足够的证据，有待进一步研究。

3结语和展望

Notch1与心血管疾病关系密切，而且逐渐成为国内外的研究热点，比如最近有报道降主动脉夹层瘤患者的血管中层平滑肌组织标本中Notch1以及其配体Delta-like 1显著减少，并提示Notch信号通路在降主动脉夹层动脉瘤中作用复杂〔25〕。目前就Notch信号通路来说，其配体、受体以及下游靶基因类型较多，且相关配体受体的功能不十分清楚，通路的组成成分复杂多样，而且Notch1信号通路可以与Wnt信号/ B连环蛋白通路、TGF-β/Smads信号转导通路构成网络桥参与心血管疾病，故需大量的实验去研究Notch1信号通路，对Notch1在心血管方面的机制有更清楚的认识，才能针对性的指导临床治疗。

4参考文献

1Brou C，Logeat F，Gupta N，etal.A novel proteolytic cleavage involved in Notch signaling：the role of the disintegrin-metalloprotease TACE〔J〕.Mol Cell，2000；5(2)：207-16.

2De Strooper B，Annaert W，Cupers P，etal.A presenilin-1-dependent gamma-secretase-like protease mediates release of Notch intracellular domain〔J〕.Nature，1999；398(6727)：518-22.

3Fortini ME.Gamma-secretase-mediated proteolysis in cell-surfacerecept or signalling〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol，2002；3(9)：673-84.

4Wu L，Aster JC，Blacklow SC，etal.MAml1，a human homologue of Drosophila mastermind，is a transcriptional co-activator for NOTCH receptors〔J〕.Nat Genet，2000；26(4)：484-9.

5Wallberg AE，Pedersen K，Lendahl U，etal.P300 and PCAF act cooperatively to mediate transcriptional activation from chromatin templates by notch intracellular domains in vitro〔J〕.Mol Cell Biol,2002；22(22)：7812-9.

6Theotokis A，Leker RR，Soldner F，etal.Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo〔J〕.Nature,2006；442(7104)：823-6.

7Baron M，Aslam H，Flasza M，etal.Multiple levels of Notch signal regulation〔J〕.Mol Membr Biol，2002;19(1)：27-38.

8Wang Y，Wu B，Chamberlain AA，etal.Endocardial to myocardial notch-wnt-Bmp axis regulates early heart valve development〔J〕.PLoS One,2013;8(4)：e60244.

9Acharya A，Hans CP，Koenig SN,etal.Inhibitory Role of notch1 in calcific aortic valve disease〔J〕.PLoS One，2011;6(11)：e27743.

10Zeng Q，Song R,Ao L,etal.Notch1 promotes the pro-osteogenic response of human aortic valve interstitial cells via modulation of ERK1/2 and NF-κB activation〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2013；33(7)：1580-90.

11Singla RD，Wang J,Singla DK,etal.Regulation of Notch 1 signaling in THP-1 cells enhances M2 macrophage 2 differentiation〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2014;307(11):H1634-42.

12Liu ZJ，Tan Y,Beecham GW,etal.Notch activation induces endothelial cell senescence and proinflammatory response：implication of notch signaling in atherosclerosis〔J〕.Atherosclerosis,2012；225(2)：296-303.

13Shin HM，Tilahun ME，Cho OH,etal.Notch1 can initiate NF-κB activation via cytosolic interactions with components of the T cell signalosome〔J〕.Front Immunol,2014;5(2):249.

14Del Papa B，Sportoletti P，Cecchini D,etal.Notch1 modulates mesenchymal stem cells mediated regulatory T-cell induction，Eur〔J〕.J Immunol,2013;43(1)：182-7.

15Lin J，Li M，Wang Z，etal.The role of CD4+CD25+ regulatory T cells in macrophage-derived foam-cell formation〔J〕.J Lipid Res,2010；51(5)：1208-17.

16Zhou X，Nicoletti A，Elhage R,etal.Transfer of CD4 T cells aggravates atherosclerosis in immunodeficient apolipoprotein E knockout mice〔J〕.Circulation,2000；102(21)：2919-22.

17Huber SA，Sakkinen P，David C，etal.T helper-cell phenotype regulates atherosclerosis in mice under conditions of mild hypercholesterolemia〔J〕.Circulation,2001；103(21)：2610-6.

18Del Monte G，Grego-Bessa J，Gonzalez-Rajal A,etal.Monitoring notch1 activity in development：evidence for a feedback regulatory loop〔J〕.Dev Dyn,2007；236(9)：2594-614.

19Grego-Bessa J，Luna-Zurita L，del Monte G,etal.Notch signaling is essential for ventricular chamber development〔J〕.Dev Cell,2007；12(3)：415-29.

20McBride KL,Riley MF,Zender GA,etal.NOTCH1 mutations in individuals with left ventricular outflow tract malformations reduce ligand-induced signaling〔J〕.Hum Mol Genet,2008；17(18)：2886.

21van den Akker NM，Molin DG,Peters PP,etal.Tetralogy of fallot and alterations in vascular endothelial growth factor-A signaling and notch signaling in mouse embryos solely expressing the VEGF 120 Isoform〔J〕.Circ Res,2007；100(6)：842-9.

22Rentschler S，Harris BS，Kuznekoff L,etal.Notch signaling regulates murine atrioventricular conduction and the formation of accessory pathways〔J〕.J Clin Invest,2011；121(2)：525-33.

23Urbanek K，Cabral-da-Silva MC，Ide-Iwata N,etal.Inhibition of notch1-dependent cardiomyogenesis leads to a dilated myopathy in the neonatal heart〔J〕.Circ Res,2010；107(3)：429-41.

24Collesi C，Zentilin L，Sinagra G,etal.Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes〔J〕.J Cell Biol,2008;183(1):1117-28.

25Zou S，Ren P，Nguyen M，etal.Notch signaling in descending thoracic aortic aneurysm and dissection〔J〕.PLoS One,2012;7(12)：e52833.

〔2015-04-17修回〕

(编辑袁左鸣)