MMP-8在不同转移潜能人肝癌细胞株的差异性表达及其对肝癌细胞迁移侵袭的影响

陈军泽，覃贵慧，骆　敏，阳　洁(.广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科，.广西医科大学药学院药理学教研室，广西南宁　5300)



MMP-8在不同转移潜能人肝癌细胞株的差异性表达及其对肝癌细胞迁移侵袭的影响

陈军泽1，覃贵慧2，骆敏2，阳洁2
(1.广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科，2.广西医科大学药学院药理学教研室，广西南宁530021)

The differential expression of matrix metalloproteinase-8 in human hepatocellular carcinoma cell lines with different metastatic potential and its influence on invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma cell lines

CHEN Jun-ze1，QIN Gui-hui2，LUO-Min2，YANG-Jie2(1.Dept of Hepatobiliary Surgery，Affiliated Cancer Hospital，Guangxi Medical University，2.Dept of Pharmacology，School of Pharmacy，Guangxi Medical University，Nanning Guangxi，530021，China)

网络出版时间:2015－6－5 11:22网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.031.html

E-mail:455622006@ qq.com;

阳洁(1978－)，女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向:肿瘤药理学，通讯作者，Tel: 0771-5350258，E-mail: yanglz2005@126.com

基质金属蛋白酶-8(matrix metalloproteinases-8，MMP-8)属于基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)家族，在肿瘤的发生发展中起重要作用。近年来研究发现，MMP-8在肿瘤侵袭转移中具有双重作用，在不同的肿瘤中，既可促进肿瘤的进展，又可抑制肿瘤的进展［1］。但目前，MMP-8与肝癌侵袭转移的关系尚不清楚。本研究通过观察不同转移潜能人肝癌细胞株的MMP-8表达情况，以及过表达MMP-8对肝癌细胞迁移侵袭的影响，以期为寻找抑制肝癌转移侵袭的分子靶点提供新的实验依据。

1　材料与方法

1.1材料实验所用细胞株均购自美国ATCC，pcDNA3.1-MMP-8重组质粒由中国广州赛业生物科技有限公司构建并测序证实;兔抗人MMP-8及β-actin一抗、HRP标记的羊抗兔二抗均购自英国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养、转染及筛选细胞株用含胎牛血清、青霉素及链霉素的DMEM高糖培养基于培养箱中常规培养。按文献方法［2］构建人MMP-8表达载体并用脂质体转染低表达MMP-8人肝癌细胞株，72 h后，以G418筛选稳定过表达MMP-8的阳性克隆，Western blot鉴定转染后MMP-8过表达效率。

1.2.2 MMP-8 mRNA及蛋白表达水平检测提取各组细胞的总RNA和蛋白质，按照试剂说明书进行RT-PCR及Western blot实验。扩增MMP-8的上游引物: 5'-GACGCTTCCATTTCTGCT-3，下游引物: 5'-TAGTGCCATTCTTCCTTG-3'。内参GAPDH的上游引物: 5'-GTCGGAGTCAACGGATTTGG-3'，下游引物: 5'-AAAAGCAGCCCTGGTGACC-3'。分别以GAPDH、β-actin为内参对MMP-8条带进行灰度分析。

1.2.3划痕、侵袭实验检测细胞迁移能力按文献方法［3］进行划痕、侵袭实验检测细胞株迁移侵袭能力，用迁移率代表细胞迁移愈合能力。迁移距离=原划痕宽度－现划痕宽度，迁移率/% =(原划痕宽度－现划痕宽度/原划痕宽度)×100%。相对侵袭率/% =处理组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数×100%。

2　结果

2.1正常人肝细胞株及不同转移潜能人肝癌细胞株中MMP-8的mRNA和蛋白表达情况结果显示，MMP-8的mRNA及蛋白在正常人肝细胞株及不同转移潜能的四株肝癌细胞中均有表达，且高转移潜能的SK-Hep1、HCCLM3的MMP-8 mRNA及蛋白表达水平较正常人肝细胞株HL7702及低转移潜能的HepG2、SMMC-7721的MMP-8 mRNA及蛋白表达水平明显增高(P＜0. 01)。而HepG2、SMMC-7721与HL7702的MMP-8 mRNA及蛋白表达水平差异没有统计学意义(P＞0. 05)。

2.2过表达MMP-8对人肝癌细胞株迁移、侵袭能力的影响结果显示，SK-Hep1、HCCLM3比HepG2、SMMC-7721的迁移侵袭能力更强(P＜0. 01)，而SK-Hep1与HCCLM3、以及HepG2与SMMC-7721的迁移能力差异没有统计学意义(P＞0. 05)。MMP-8过表达后，HepG2-MMP-8组及SMMC-7721-MMP-8组细胞的迁移、侵袭能力均比HepG2-vector组及SMMC-7721-vector组细胞明显增强(P＜0. 01)，而HepG2-vector组及SMMC-7721-vector组和相应的野生组的迁移、侵袭能力差异均没有统计学意义(P＞0. 05)。

3　讨论

MMP-8与肿瘤发生发展关系密切。近年的研究表明，MMP-8在肿瘤生长、侵袭、转移中具有双重作用。Korpi等［4］发现，MMP-8表达与改善舌癌患者生存呈正相关，且MMP-8缺失小鼠比野生型小鼠的舌癌发生率明显增高;而Stadlmann等［5］报道，MMP-8在人卵巢癌组织中高表达，能明显增强卵巢癌细胞的侵袭潜能。此外，血清MMP-8水平低的肝癌患者总生存率明显高于血清MMP-8水平高的肝癌患者，提示血清MMP-8水平可作为预测肝癌预后的一个指标［6］。在本研究中我们发现，MMP-8在高转移潜能的肝癌细胞SK-Hep1、HCCLM3中高表达，在正常人肝细胞HL7702及低转移潜能的人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721中低表达，且MMP-8的表达水平与肝癌细胞的迁移及侵袭能力呈正相关。过表达MMP-8能明显增强低转移潜能肝癌细胞HepG2 和SMMC-7721的迁移及侵袭能力。这些结果提示，MMP-8表达水平与肝癌细胞的迁移侵袭潜能呈正相关，MMP-8可促进肝癌细胞的恶性进展。

近期研究发现，许多MMPs能诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，从而促进肿瘤侵袭转移。例如，MMP-2、-3、-7、-9、-13、-14可分别诱导黑色素瘤、纤维肉瘤、肺腺癌细胞等肿瘤细胞发生EMT、减少粘附，增加迁移和侵袭能力［7-8］。因此，我们推测，MMP-8促进肝癌细胞迁移侵袭的机制可能也与诱导肝癌细胞的EMT转化密切相关。

综上所述，我们的研究证实了MMP-8在高转移潜能的人肝癌细胞中高表达，并能促进肝癌细胞的迁移和侵袭。但MMP-8促进肝癌细胞侵袭迁移的机制，以及能否真正成为肝癌的药物干预靶点及独立的预后指标还需要进一步的研究证实。

参考文献:

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［2］Siller-Lopez F，Garcia-Banuelos J，Hasty K A，et al.Truncated active matrix metalloproteinase-8 gene expression in HepG2 cells is active against native type I collagen［J］.J Hepatol，2000，33(5): 758－63.

［3］杨云，董琳，黄圣旺，等.硫化氢下调MMP-9的表达抑制肝癌HepG2细胞的迁移［J］.中国药理学通报，2013，29(12): 1676－9.

［3］Yang Y，Dong L，Huang S W，et al.Hydrogen sulfide downregulates MMP-9 expression and inhibits migration of HepG2 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29(12):1676－9.

［4］Korpi J T，Kervinen V，Maklin H，et al.Collagenase-2(matrix metalloproteinase-8)plays a protective role in tongue cancer［J］.Br J Cancer，2008.98(4):766－75.

［5］Stadlmann S，Pollheimer J，Moser P L，et al.Cytokine-regulated expression of collagenase-2(MMP-8)is involved in the progression of ovarian cancer［J］.Eur J Cancer，2003，39(17): 2499－505.

［6］Lempinen M，Lyytinen I，Nordin A，et al.Prognostic value of serum MMP-8，-9 and TIMP-1 in patients with hepatocellular carcinoma［J］.Ann Med，2013，45(7):482－7.

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［8］McGuire J K，Li Q，Parks W C.Matrilysin(matrix metalloproteinase-7)mediates E-cadherin ectodomain shedding in injured lung epithelium［J］.Am J Pathol，2003，162(6):1831－43.

中国图书分类号: R345.9; R73-37; R735.702.2; R977.3

关键词:基质金属蛋白酶-8;肝癌细胞;迁移;侵袭;转染;逆转录－聚合酶链反应;蛋白免疫印迹

Key words:matrix metalloproteinase-8; hepatocellular carcinoma cell lines; migration; invasion; transfection; RT-PCR; Western blot

基金项目:广西自然科学基金青年基金项目(No 2012GXNSFBA053096)

作者简介:陈军泽(1988－)，男，硕士生，研究方向:肿瘤学，外科学，

收稿日期:2015－03－08，修回日期:2015－04－09

文献标志码:A

文章编号:1001－1978(2015)07－1035－02

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.031