瘤果黑种草子中磷脂类成分的研究

李 静，刘玉明*，刘庆华，李 微

(1.天津理工大学化学化工学院，天津 300384;2.新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆 乌鲁木齐 830004)

瘤果黑种草Nigella glandulifera Freyn et Sint.为毛茛科黑种草属植物，主产新疆，瘤果黑种草子作为维药收入1977年至今各版《中国药典》，功效为利尿、活血、解毒、通乳;还可乌发、抗衰老。现代药理研究发现，瘤果黑种草子提取物及其化学成分具有抗肿瘤的活性［1-2］。目前已从该植物中分离得到多个化学成分［3-9］。本课题组为了寻找其中水溶性且具有生物活性的天然产物，以进一步了解该植物的药效物质基础，对该植物种子水溶性部位进行了深入细致的化学成分研究，从中分离得到了5个化学成分，化合物3、4和5为磷脂类化合物，且为首次从该属植物中分离得到，其中化合物5为新化合物。

1 仪器与材料

Bruker Avance III 400 MHz型核磁共振仪;Finnigan Surveyor LC-LCQ Advantage Max型质谱仪;Bruker micrOTOF-Q II型高分辨质谱仪;Elementar Vario EL cube型元素分析仪;北京泰克仪器有限公司生产的X-4型显微熔点仪;瑞士BUCHI公司生产的C-605型中压制备系统。色谱用硅胶 (100～200目，硅胶H)为青岛海洋化工厂产品。所用试剂均为分析纯。瘤果黑种草子于2011年2月购于新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市，经新疆维吾尔自治区药物研究所刘庆华研究员鉴定为Nigella glandulifera Freyn et Sint.的种子。

2 提取与分离

取榨过油的黑种草子饼18 kg，经95%乙醇水溶液回流提取2次，50%乙醇水溶液回流提取2次，水回流提取2次，每次3 h，合并提取液，减压浓缩得到总浸膏2630 g。将所得浸膏分散于3倍体积的温水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂得石油醚部分840 g、乙酸乙酯部分80 g和正丁醇部分560 g。剩余水层浓缩得到1100 g，将此水部分经硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇 (10∶1～0∶1)梯度洗脱，经TLC检测合并，得到15份流份。其中第8份流份经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇-水 (12∶4∶0.5)洗脱，得化合物1(1.5 g);第10份流份经多次硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇-水 (7∶3∶0.5)反复硅胶柱色谱，得化合物2(2.2 g)和化合物3(83 mg);第12份流份经反复MPLC硅胶柱分离，以纯甲醇洗脱，得化合物4(116 mg)和化合物5(19 mg)。

3 结构鉴定

化合物1:白色粉末，mp 248～250℃，［α］25D－23.1(c=0.50，MeOH).Libermann-Burchard反应阳性，Molish反应阳性，薄层酸水解后TLC显示有葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和鼠李糖。HR-ESIMS(positive mode)m/z 1375.6460 ［M+Na］+(calcd 1375.6510 for C64H104O30Na).1H-NMR(C5D5N) δ:0.85、0.87、0.96、1.10、1.14、1.17(各3H，s，6×Me)，1.53(3H，d，J=6.2 Hz，Me of Rha in 3-O-Glycosyl moiety)，1.68(3H，d，J=6.2 Hz，Me of Rha in 28-O-Glycosyl moiety)，4.98(lH，d，J=7.8 Hz，Glc H-l)，5.05(lH，d，J=6.7 Hz，Ara H-l)，5.34(1H，d，J=7.6 Hz，Xyl 1-H)，5.38(1H，br s，12-H)，5.84(1H，s，1-H of Rha in 28-O-Glycosyl moiety)，6.23(lH，d，J=8.0 Hz，ester Glc H-l)，6.35(lH，s，1-H of Rha in 3-O-Glycosyl moiety)。13C-NMR(C5D5N) δ:176.7(C-28)，144.2(C-13)，123.0(C-12)，107.5(Xyl-1)，104.9(Glc-1)，104.7(Ara-1)，102.8(Rha-1in 28-O-Glycosyl moiety)，101.3(Rha-1)，95.7(ester Glc-1)，82.9(Rha-3)，81.2(C-3)，78.7(Glc-4)，78.5(ester Glc-3)，78.4(Xyl-3)，78.1(ester Glc-5)，77.2(Glc-5)，76.6(Glc-3)，75.7(Ara-2)，75.4(Xyl-2 and Glc-2)，75.1(Ara-3)，74.1(Rha-4 in 28-O-Glycosyl moiety)，74.0(ester Glc-2)，73.0(Rha-4)，72.8(Rha-3 in 28-O-Glycosyl moiety)，72.6(Rha-2 in 28-O-Glycosyl moiety)，72.0(Rha-2)，71.2(Xyl-4)，70.9(ester Glc-4)，70.4(Rha-5 in 28-O-Glycosyl moiety)，69.8(Rha-5)，69.7(Ara-4)，69.3(ester Glc-6)，67.4(Xyl-5)，66.2(Ara-5)，64.1(C-23)，61.4(Glc-6)，48.3(C-9)，47.7(C-5)，47.1(C-17)，46.3(C-19)，43.7(C-4)，42.2(C-14)，41.7(C-18)，40.0(C-8)，39.1(C-1)，37.0(C-10)，34.1(C-21)，33.2(C-29)，32.8(C-22)，32.6(C-7)，30.8(C-20)，28.4(C-15)，26.4(C-2)，26.2(C-27)，23.9(C-11)，23.8(C-30)，23.4(C-16)，18.6(Rha-6)，18.5(Rha-6 in 28-O-Glycosyl moiety)，18.2(C-6)，17.6(C-26)，16.3(C-25)，14.2(C-24)。根据以上理化性质及光谱数据，对照文献 ［10］，鉴定化合物1为异株五加甲苷。

化合物2:无色黏稠液体。1H-NMR(D2O)δ:3.56(2H，dd，J=6.5，11.7 Hz，H-1A，3A)，3.65(2H，dd，J=4.3，11.7 Hz，H-1B，3B)，3.78(1H，m，H-2).13C-NMR(D2O)δ:62.5(C-1，3)，72.1(C-2)。根据以上理化性质及光谱数据，对照文献 ［11］，鉴定化合物2为甘油。

化合物3:无色黏稠液体。ESI-MS，m/z(positive mode):104.1［C5H13NO+H，胆碱基］+，184.2，342.5，368.5［M-C11H22+H］+，522.5［M+H］+，544.5［M+Na］+，560.5 ［M+K］+.1H-NMR(CD3OD)δ:0.89(3H，t，J=6.4 Hz，18'-CH3)，1.27(20H，br s，H-4'to H-7'，and H-12'to H-17')，1.59(2H，br s，H-3')，2.01(4H，br s，H-8'and H-11')，2.34(2H，t，J=7.4 Hz，H-2')，3.21(9H，s，3×-NCH3)，3.63(2H，like-t，H-5)，3.89(2H，m，H-3)，3.96(1H，m，H-2)，4.09(1H，dd，J=6.1，11.3 Hz，H-1A)，4.16(1H，dd，J=4.5，11.3 Hz，H-1B)，4.29(2H，br s，H-4)，5.33(2H，m，H-9'and H-10').13C-NMR(CD3OD):δ:64.8(s，C-1)，68.5(d，JC-P=7.5 Hz，C-2)，66.4(d，JC-P=5.8 Hz，C-3)，59.0(d，JC-P=5.0 Hz，C-4)，66.1(m，C-5)，53.3(t，JC-N=3.7 Hz，3 ×-NCH3)，173.9(C-1')，33.5(C-2')，24.6(C-3')，28.8-29.4(C-4'to C-7'，and C-12'to C-15')，26.7(C-8'and C-11')，129.5(C-9')，129.4(C-10')，31.6(C-16')，22.3(C-17')，13.0(C-18')。根据以上理化性质及光谱数据，对照文献 ［12］，鉴定化合物3为1-油酰-甘油-3-磷酰胆碱。

化合物4:无色黏稠液体。ESI-MS，m/z(positive mode):104.2［C5H13NO+H，胆碱基］+，258.3［M+H］+，280.2 ［M+Na］+，361.2，515.4［2M+H］+，537.4［2M+Na］+，618.3［2M+C5H13NO+H，即2M+胆碱基 +H］+，772.3［3M+H］+，794.3［3M+Na］+， 810.4 ［3M+K］+。HR-ESI-MS， m/z:280.0934 ［M+Na］+(C8H20PNO6Na，280.0926)。1H-NMR(CD3OD)δ:3.22(9H，s，3×-NCH3)，3.54(1H，dd，J=5.6，11.4 Hz，H-1A)，3.59(1H，dd，J=5.4，11.4 Hz，H-1B)，3.64(2H，like-t，H-5)，3.76(1H，m，H-2)，3.86(1H，m，H-3A)，3.91(1H，m，H-3B)，4.29(2H，br s，H-4)。13C-NMR(CD3OD):δC62.4(s，C-1)，71.1(d，JC-P=7.6 Hz，C-2)，66.5(d，JC-P=5.8 Hz，C-3)，59.0(d，JC-P=5.0 Hz，C-4)，66.0(m，C-5)，53.3(t，JC-N=3.7 Hz，3 ×-NCH3)。以上理化性质及光谱数据与文献［13］分析一致，鉴定化合物4为甘油磷酰胆碱。

化合物5:无色黏稠液体。ESI-MS，m/z(正离子模式):579.1［2M+H］+.HR-ESI-MS(正离子模式)m/z 579.1230［2M+H］+(calcd 579.1232 for C16H41N2O8P2S4).Anal.calcd.for C8H20NO4PS2(%):C=33.15;H=7.13;N=4.83;S=22.12;O=22.08，Found:C=33.42;H=7.28;N=4.67;S=21.85;O=22.19.1H-NMR(CD3OD)δ:3.22(9H，s，3 ×-NCH3)，3.49(2H，m，H-5)，3.56(1H，dd，J=5.6，11.4 Hz，H-1A)，3.63(1H，dd，J=5.2，11.4 Hz，H-1B)，3.76(1H，m，H-2)，3.89(1H，m，H-3A)，3.91(1H，m，H-3B)，4.01(2H，m，H-4).13C-NMR(CD3OD)δ:62.5(s，C-1)，71.4(d，JC-P=6.7 Hz，C-2)，65.8(d，JC-P=5.4 Hz，C-3)，55.7(d，JC-P=0.8 Hz，C-4)，67.7(m，C-5)，53.3(t，JC-N=3.8 Hz，3×-NCH3)。根据氢谱、碳谱、ESI-MS谱、HR-ESI-MS谱和元素分析综合判断，其相对分子质量为289，分子式为C8H20NO4PS2。化合物5和上述化合物4的核磁共振图谱相似，DEPT谱显示两者都有1个次甲基、4个亚甲基和3个甲基，且同样受到磷核和季氮核的偶合裂分，由此推断化合物5也为磷酰胆碱类化合物。将上述化合物5的氢谱和碳谱数据与化合物4的相应数据比较后发现，两者的丙三醇基片段部分和胆碱基片段部分化学位移极为相近，化合物5的C3和(或)C4位的氢谱和碳谱数据没有出现显著的高场位移，提示化合物5中两硫原子不与此两片段相连接，故只能与磷原子直接相连。通过以上分析，结合1H-1H COSY、HSQC、HMBC和NOESY谱进一步确证，鉴定化合物5的结构为O-(1-丙三醇基)-O-(2-胆碱基)二硫代磷酸酯。

［1］中华本草编委会.中华本草:第三册［M］.上海:上海科学技术出版社，1999:236-237.

［2］Tian Z，Liu Y M，Chen S B，et al.Cytotoxicity of two triterpenoids from Nigella glandulifera［J］.Molecules，2006，11(9):693-699.

［3］郝海峰，任丽娟，陈玉武.黑种草子化学成分研究［J］.药学学报，1996，31(9):689-694.

［4］Liu Y M，Yang J S，Liu Q H.A new alkaloid and its artificial derivative with indazole ring from Nigella glandulifera ［J］.Chem Pharm Bull，2004，52(4):454-455.

［5］刘玉明，杨峻山，刘庆华.瘤果黑种草子化学成分的研究［J］.中国中药杂志，2005，30(13):980-983.

［6］Liu Y M，Liu Q H，Chen B Q.A new flavonol glycoside from the seeds of Nigella glandulifera ［J］.Nat Pro Res，2011，25(14):1334-1338.

［7］Feng Y，Liu Y M，Liu Q H，et al.Nigelactone，new phthalide glucoside from the seeds Nigella glandulifera［J］.Heterocycles，2012，85(12):3015-3019.

［8］Liu Y M，Sun L，Liu Q H，et al.Dolabellane-type diterpene alkaloids from Nigella glandulifera ［J］.Biochem Syst Ecol，2013，49:43-46.

［9］Liu Y M，Jiang Y H，Liu Q H，et al.Indazole-type alkaloids from the seeds of Nigella glandulifera ［J］.Phytochem Lett，2013，6(4):556-559.

［10］Sawada H，Miyakoshi M，Isoda S，et al.Saponins from leaves of Acanthopanax sieboldianus［J］.Phytochemistry，1993，34(4):1117-1121.

［11］刘玉明，梁光义，徐必学.苗族药马蹄金化学成分的研究［J］.天然产物研究与开发，2003，15(1):15-17.

［12］Leaon F，Boven M V，Witte P，et al.Isolation and identification of molecular species of phosphatidylcholine and lysophosphatidylcholine from Jojoba Seed Meal［J］.J Agric Food Chem，2004，52(5):1207-1211.

［13］Xu F G，Zou L，Lin Q S，et al.Use of liquid chromatography/tandem mass spectrometry and online databases for identification of phosphocholines and lysophosphatidylcholines in human red blood cells［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2009，23(19):3243-3254.