丙酮-K2HPO4双水相体系萃取大蓟总黄酮

丁 霞，　张允楠，　杨 云，　钟凌云

（1.南京农业大学理学院，江苏　南京　210095；2.江西中医学院药学院，江西　南昌　330004）

丙酮-K2HPO4双水相体系萃取大蓟总黄酮

丁 霞1，张允楠1，杨 云1，钟凌云2

（1.南京农业大学理学院，江苏南京210095；2.江西中医学院药学院，江西南昌330004）

目的 建立双水相萃取大蓟总黄酮的工艺参数。方法 以丙酮-K2HPO4为双水相萃取体系，分配系数K和萃取率Y为考察指标，通过丙酮体积分数、K2HPO4质量浓度、pH、温度等单因素分析考察双水相萃取大蓟总黄酮的最佳工艺条件。结果 其工艺参数为：丙酮体积分数70%，K2HPO4的质量浓度0.24 g/mL，pH 8.0，室温。在该工艺条件下大蓟总黄酮在两相中的分配系数达7.81，萃取得率达96.8%，黄酮浸膏纯度达89.8%。结论 该方法稳定可行，操作简便快速，廉价，萃取得率高，可用于分离纯化大蓟总黄酮。

大蓟；总黄酮；双水相体系

大蓟是菊科植物蓟Cirsiu japonicum var.Fisch.ex DC.的干燥地上部分，其味甘、苦，性凉，归心、肝经，有凉血、止血、祛瘀、消痈肿的作用［1］。大蓟含有多种化学成分，主要有三萜和甾体类、挥发油类、长链炔烯醇类、黄酮和黄酮苷类等化合物。药理研究显示大蓟黄酮具有抗氧化、止血、抗肿瘤、抗糖尿病等药理作用［2-4］。

双水相萃取技术是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下可以形成双水相，由于被分离物在两相中的分配不同，便可实现分离［5-6］。事实上，能与水互溶的有机溶剂在无机盐的存在下也可生成双水相体系，这种新型的双水相体系具有价廉、低毒、易回收且无需反萃和避免使用黏稠水溶性高聚物等特点，在天然产物的提取分离中已显示出良好的应用前景［7-8］。本实验采用丙酮-K2HPO4双水相体系萃取分离大蓟总黄酮，探讨了丙酮体积分数、K2HPO4质量浓度、pH以及温度等单因素对大蓟黄酮在该体系的分配系数和萃取率的影响，为工业化利用大蓟提供重要依据。

1　仪器与材料

KQ-500型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HHS型电热恒温水浴锅（上海博迅公司医疗设备厂）；JB-2型恒温磁力搅拌器（上海雷磁新泾仪器公司）；T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；pHS-25型酸度计（上海精密科学仪器有限公司）。芦丁对照品（批号100080-200306，含量测定用，中国药品生物制品检定所），大蓟（产地安徽，批号110815），磷酸氢二钾、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、丙酮及其他试剂均为分析纯。

2　方法

2.1大蓟醇提物的制备 精密称取100.0 g大蓟，加10倍量体积的石油醚，超声提取2次，每次30 min。过滤，挥尽石油醚，残渣中按料液比1∶8的量加入70%乙醇超声提取2次，每次30 min。过滤，合并滤液，旋转蒸发挥去溶剂得大蓟醇提浸膏，4℃冰箱保存备用。

2.2双水相体系的制备 在20 mL的具塞试管中加入一定量的丙酮/乙醇、K2HPO4/（NH4）2SO4和水，使体系总体积为20 mL，振荡2～3 min，静置，待溶液分相后，读取上相与下相的体积，计算V终/V始，V始为有机溶剂的加入量（mL），V终为成相后有机相的体积。根据V终/V始的计算结果，评价成相行为，确定双水相体系［9］。

2.3萃取条件的优化 在双水相体系中加入0.15 g醇提浸膏，以分配系数K和回收率Y为指标，考察K2HPO4质量浓度、pH、温度及样品的加入量对萃取效果的影响。溶液分相后分别读取上、下相体积，并取样分析上、下相中大蓟总黄酮的量。按下式计算黄酮的K和Y：

式中：K为黄酮在双水相体系中的分配系数，ρt、ρb分别为上、下相黄酮的质量浓度（mg/mL）；Y为黄酮在上相中的萃取率，R为相比，R=Vt/Vb，Vt、Vb分别为上、下相体积（mL）。

2.4总黄酮的测定［10］

2.4.1标准曲线绘制 精确称取芦丁对照品21.30 mg置于100 mL量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度，配制成质量浓度为0.213 0 mg/mL的芦丁标准溶液。准确移取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL上述对照品溶液，分别置于25 mL量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，放置6 min；加入10%的硝酸铝1.0 mL，放置6 min，加入4%氢氧化钠4.0 mL，加水至刻度，摇匀。在510 nm处测定吸收值。以吸光度A为纵坐标，以芦丁标准溶液质量浓度C（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为A=8.752 5C-0.017 3，结果表明大蓟黄酮在8.5～51.1 mg/L范围内线性关系良好（r=0.999 7）。

2.4.2样品中总黄酮的测定 吸取上相或下相样品溶液1.00 mL于25 mL量瓶中，按照“2.4.1”项下方法，测定吸光度，代入标准曲线计算黄酮的量。

2.5验证试验 称取大蓟醇提物0.15 g，按最佳工艺条件进行双水相萃取，读取上、下相体积，分析上、下相中大蓟总黄酮的量，计算R、K和Y。

2.6总黄酮纯化倍数的测定 按最佳工艺条件对大蓟醇提浸膏进行双水相萃取，取丙酮相（上相）挥干溶剂，得黄酮浸膏。分别精密称取3份醇提浸膏和黄酮浸膏，配置成质量浓度为1.0 mg/mL的供试液，按照“2.4.1”项下方法，测定黄酮，计算萃取后黄酮的纯化倍数。

3　结果

3.1丙酮与K2HPO4加入量对双水相成相行为的影响 对丙酮、乙醇与（NH4）2SO4、K2HPO4进行亲水有机溶剂与盐的两两组合的4个双水相体系的成相研究，结果显示：丙酮-K2HPO4-H2O体系中，V终/V始最趋近于1，且成相速度快，故选择该体系作为双水相体系。改变体系中丙酮及K2HPO4的加入量，以V终/V始（V终/V始趋近于1）为评价指标，考察丙酮和K2HPO4加入量对双水相成相行为的影响，实验结果如图1所示。

图1　K2HPO4与丙酮加入量对双水相成相行为的影响

由图1可知，丙酮体积分数（φ丙酮）增大时，分相所需的K2HPO4的最低量降低，但无机盐的溶解度会下降。随着K2HPO4的加入的量提高，V终/V始越趋近于1。在丙酮体积分数φ丙酮=70%时，K2HPO4的加入量ρ（K2HPO4）＞0.20 g/mL，V终/V始趋近于1（＜1.1），有好的成相行为，但K2HPO4的加入量ρ（K2HPO4）＞0.30 g/mL下相黏度显著增大，分相操作困难。φ丙酮＞70%时，虽易成相，且V终/V始趋近于1所需的K2HPO4的量更低，但K2HPO4溶解度下降且下相黏度明显增大。故确定丙酮体积分数（φ丙酮）为70%（V/V），K2HPO4的加入量在0.25 g/mL左右，为萃取大蓟总黄酮合适的双水相体系。

3.2K2HPO4加入量对双水相萃取大蓟黄酮萃取效果的影响 室温（25℃）下，φ丙酮=70%，改变K2HPO4质量浓度（0.20～0.30 g/mL），K2HPO4加入量对萃取效果的影响如表1所示。由表1可知，ρ（K2HPO4）=0.24 g/mL时，大蓟黄酮有最大的分配系数和萃取率，故确定K2HPO4的加入量为0.24 g/mL。

表1　磷酸氢二钾的加入量对分配系数及萃取率的影响

3.3pH对双水相萃取大蓟黄酮萃取效果的影响 室温（25℃）下，φ丙酮=70%，ρ（K2HPO4）=0.24 g/mL，改变体系的pH（8～12），考察pH值对K和Y的影响，实验结果如表2所示。由表2可知，pH越小，K和Y越大，但pH＜8.0时，下相出现了白色絮状物，故确定pH=8.0为最佳pH。

表2　pH对分配系数及萃取率的影响

3.4温度对双水相萃取大蓟黄酮萃取效果的影响 φ丙酮= 70%，ρ（K2HPO4）=0.24 g/mL，pH=8.0，改变温度（10～60℃），考察温度对双水相萃取效果的影响，实验结果如表3所示。由表3可知，当温度＜50℃时，温度对K、Y影响不大，温度的影响可忽略，故取常温下（20～30℃）进行双水相萃取即可。

3.5样品加入量对双水相萃取大蓟黄酮萃取效果的影响

室温（25℃）下，φ丙酮=70%，ρ（K2HPO4）=0.24 g/mL，pH=8.0，考察醇提浸膏的加入量（0.05～0.50 g）对黄酮萃取效果的影响，实验结果如表4所示。由表4所示，醇提浸膏的加入量在2.5～25mg/mL范围内K、Y基本保持不变，符合分配定律。

表3　温度对分配系数及萃取率的影响

表4　样品加入量对分配系数及萃取率的影响

3.6验证试验结果 精密称取3份大蓟醇提浸膏各0.15 g，按实验获得的最佳萃取工艺条件即φ丙酮=70%，ρ（K2HPO4）=0.24g/mL，pH=8.0，25℃，在丙酮-K2HPO4双水相体系中萃取大蓟总黄酮，测定上、下相中黄酮含有量，计算R、K和Y，实验结果如表5所示。

表5　验证试验结果

实验结果表明在最佳萃取工艺条件下，在两相中黄酮的分配系数平均值为7.81（n=3，RSD=0.5%），丙酮相中黄酮的最大萃取率可达96.8%（n=3，RSD=0.6%）。

3.7纯化倍数 按照最佳工艺条件萃取大蓟黄酮，测定萃取前后浸膏中总黄酮的量，实验结果显示萃取前后浸膏中总黄酮的含有量分别为34.6%（n=3，RSD=1.5%）和89.8%（n=3，RSD=2.2%），萃取后浸膏中总黄酮的含有量是萃取前的2.6倍。

4　结论

4.1实验结果表明利用丙酮-K2HPO4双水相体系萃取大蓟中的总黄酮，最佳工艺条件为：φ丙酮=70%，ρ（K2HPO4）=0.24g/mL，pH=8，室温。在最佳工艺条件下大蓟黄酮在两相中的最大分配系数可达7.81，上相中最大萃取率达96.8%。大蓟醇提物的质量浓度在2.5～25 mg/mL范围内，在两相中的分配符合分配定律。双水相萃取后大蓟总黄酮纯度提高了1.6倍，纯度达89.8%。

4.2双水相萃取是一种可以不需要使用复杂设备，并在温和条件下进行简单的操作就可获得较高收率的有效成分的新型分离技术。但在应用和研究过程中仍存在着易乳化、成相聚合物成本较高、水溶性高聚物大多数黏度较大、不易定量控制，高聚物回收困难等技术难题。而本实验中采用丙酮-K2HPO4-H2O体系是基于与水互溶的有机溶剂和盐水的双水相萃取体系，该体系具有溶剂价廉、低毒、易回收，避免使用高聚物等特点，克服了一般双水相体系的不足。实验结果显示这种新型的亲水有机溶剂与盐水组成的双水相体系萃取大蓟黄酮，萃取效果佳、纯化倍数高、操作简便快速、重复性好，有望应用于工业化生产。

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R284.2

B

1001-1528（2015）01-0231-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.053

2013-07-18

江西省对外科技合作项目（赣财教［2008］212）

丁 霞（1963—），女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药药效成分。Te1：（025）84396697，E-mai1：dingxia@ njau.edu.cn