响应面法优化马兰多糖提取工艺研究

俞 娟，　刘劲松，　王 刚，　王 诤，　蔡百祥，　王国凯

（安徽中医药大学药学院，现代中药安徽省重点实验室，安徽　合肥　230012）

响应面法优化马兰多糖提取工艺研究

俞 娟，刘劲松，王 刚，王 诤，蔡百祥，王国凯*

（安徽中医药大学药学院，现代中药安徽省重点实验室，安徽合肥230012）

目的 通过响应面法研究和优化马兰多糖的提取工艺。方法 在单因素试验结果的基础上，运用响应面法的设计，对马兰多糖的提取工艺各因素进行优化。结果 最佳优化提取工艺是料液比为25∶1，提取时间为1.55 h，提取次数为4次。在该优化条件下，马兰多糖的实际平均提取率为8.17%。结论 该优化工艺稳定可靠，实验值与建立的模型预测值基本一致。

马兰；多糖；响应面法；提取工艺

马兰为菊科植物马兰属马兰Kalimeris indica（L.）Sch-Bip的带根全草，全国均有分布［1］。现代药理研究证明，马兰具有镇痛、镇咳、抗胃溃疡等作用［2-3］，在四川民间常用其煎服，用于治疗胃脘疼痛以及慢性胃炎，颇具疗效［4-5］。且有研究表明马兰多糖具有抗胃溃疡作用［6-7］。响应面分析法是一种广泛用于优化工艺条件的方法［8］。本实验采用响应面法优化马兰多糖的提取工艺，为马兰的工艺研究提供理论依据。

1　材料与仪器

1.1材料 马兰药材于2014年购自亳州药材市场，经安徽中医药大学杨青山鉴定为菊科植物马兰K.indica（L.）Sch-Bip的干燥全草。凭证标本（No.200401）保存于安徽中医药大学药物化学系天然药化研究室。所用试剂均为分析纯。

1.2仪器 UV759CRT分光光度计（岛津）；DZF6050型真空干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；HH-S恒温水浴锅（江苏国胜实验仪器厂）；十万分之一电子天平（赛多利斯公司）。

2　方法与结果

2.1多糖提取 称取马兰药材50 g，加蒸馏水，回流提取，浓缩，真空干燥至恒定质量，称定质量。

2.2马兰多糖的测定（硫酸-苯酚法［9］）

2.2.1标准曲线的制备 取葡萄糖对照品0.100 0 g，精密称定，置于100 mL量瓶中加蒸馏水溶解并定容至刻度。准确吸取对照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL于10 mL刻度试管中，分别加入2.0 mL蒸馏水，再分别加6%苯酚1.0mL及浓硫酸5.0mL，加水定容至刻度，静置10min，再放入沸水浴中15min。同法制得空白对照。在多糖最大吸收波长490nm处测定其吸光度，计算其标准曲线回归方程Y=7.74Ⅹ-0.0301（r=0.9991），表明多糖在0.105～0.504mg/mL质量浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.2.2供试品溶液制备 取样品0.1000g，配成100mL溶液，精密移取0.50mL于10mL试管中，按“2.2.1”项下操作，测定吸光度，计算马兰多糖的提取率：提取率（%）=多糖的质量浓度（mg/mL）×溶液体积（mL）×稀释倍数/原料质量（g）×10-3×100

2.2.3精密度 取同一份供试品溶液，连续平行测定6次，RSD值为1.9%，表明仪器精密度良好。

2.2.4重复性 精密称取样品6份，精密称定，按“2.2.1”项下同法进行提取，分别测定吸光度，RSD值为1.3%，表明本法重复性良好。

2.2.5稳定性 取同一份供试品溶液，在0、5、10、20、30、60min分别测定其吸光度，RSD值为0.7%，表明样品溶液在60min内基本稳定。

2.2.6加样回收率 取已知含有量的多糖提取物6份，精密称定，分别加入对照品，按“2.2.1”项下同法进行处理，分别测定吸光度，计算平均回收率为99.4%，RSD值为1.9%，结果表明本法回收率良好。

2.3单因素水平试验 结果如图1所示，最佳料液比25倍，最佳提取时间1.5h，最佳提取次数3次。

图1　单因素试验结果

2.4响应面法优化马兰多糖的提取工艺

2.4.1实验结果及分析 在单因素试验结果的基础上，按照中心组合试验设计原理［10］，参考文献［11-14］选取料液比、提取时间、提取次数进行三因素三水平的实验设计，因素水平分别以-1、0、1编码，以马兰多糖的得率为响应值，见表1。

表1　响应面优化三因素三水平

以料液比（A）、提取时间（B）、提取次数（C）为自变量，以马兰多糖含有量（Y）为响应值，用Design-Expert 8.0.5b软件进行三因素三水平的响应面数据分析，结果见表2。

表2　响应面优化实验设计及结果

分析上述数据，回归方程为：Y=8.00+0.25A+ 0.43B+0.45C+0.028AB-0.42AC-0.34BC-0.87A2-0.91B2-0.29C2。结果可知，三个因素对马兰多糖提取率的影响大小为：C＞B＞A。结果见表3。注：*P＜0.05为显著水平，**P＜0.01为极显著水平

表3　拟合回归分析结果

表3表明A、B、C、AC、BC、A2、B2、C2因素对多糖的提取率影响显著，表明三个因素对马兰多糖的提取均有显著的影响；其中料液比和提取时间以及提取时间和提取次数的交互作用也会对马兰多糖提取率带有显著影响。进一步分析方程方差可知，由总模型P＜0.001可知本实验所选取的二次多项式模型具有高度的显著性；失拟项为0.1824＞0.05，故失拟项不显著；R2=0.9757和R2

Adj= 0.9444说明模型可以解释94.44%响应值的变化，只有总变异的5.56%不可以用此模型解释，说明该模型的拟合度较好。

2.4.2 响应面图与等高线图分析 根据多元回归方程得到的三因素对马兰多糖提取率影响的响应面图和等高线图。图2说明料液比和提取时间之间的交互作用不显著；当料液比不变，马兰多糖提取率随着提取时间的增大表现为先上升后下降；当提取时间不变，马兰多糖提取率随着料液比的增大表现为先上升后下降。

图2　料液比与提取时间对马兰多糖提取率的响应面及其等高线

图3说明料液比和提取次数之间的交互作用显著；当料液比较小，马兰多糖提取率随着提取次数的增大表现为先上升后下降，当料液比达到一定值，马兰多糖提取率随着提取次数的增大趋于平缓；当提取次数不变，提取率随着料液比的增大表现为先上升后下降。

图3　料液比与提取次数对马兰多糖提取率的响应面及其等高线

图4说明提取时间和提取次数之间的交互作用显著；当提取时间较小，马兰多糖提取率随着提取次数的增大表现为先上升，当提取时间达到一定值，马兰多糖提取率随着提取次数的增大表现为先上升后下降；当提取次数不变，马兰多糖提取率随着提取时间的增大而先上升后下降。

图4　提取时间与提取次数对马兰多糖提取率的响应面及其等高线图

2.4.3最佳条件预测及验证试验 通过Design-Expert 8.0.5b软件进行数据分析，得到马兰多糖提取的最佳工艺条件是料液比为24.84∶1；提取时间为1.55 h；提取次数为3.73次。马兰多糖提取率的理论值为8.18%。考虑实际情况，确定最佳提取工艺条件是料液比为25∶1；提取时间为1.55 h；提取次数为4次。在此条件下提取3批，实际提取率分别为8.13%、8.18%、8.19%，平均值为8.17%，与理论值8.18%接近。

4　讨论

目前关于多糖提取工艺研究报道主要通过正交实验设计，而其只通过因素水平组合，无法优选出因素的最佳组合。本实验采用响应面法，将因素与结果的关系进行多项式拟合，优选马兰多糖最佳提取工艺。首先采用单因素试验确定因素水平，进一步应用响应面分析法考察因素对提取的影响，采用二次回归设计得到马兰多糖提取率的回归模型，验证试验表明了该模型的可靠性。

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R284.2

B

1001-1528（2015）01-0222-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.051

2014-08-28

国家自然科学基金项目（81303220）；安徽省自然科学基金项目（11040606M220）

俞 娟（1981—），女，硕士，讲师，主要从事中药化学成分研究。Te1：（0551）68129055，E-mai1：54795150@qq.com

王国凯（1981—），男，博士，副教授，主要从事中药化学活性成分研究。Te1：（0551）68129167，E-mai1：wanggk7779 @163.com