山羊痘病毒反向间接血凝试验方法的建立

陈伯祥 杨 明 李 杰

（甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉 744000）

山羊痘病毒反向间接血凝试验方法的建立

陈伯祥 杨 明 李 杰

（甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉 744000）

山羊痘（Goat pox，GTP）是由山羊痘病毒引起的一种全身皮肤、呼吸道、消化道黏膜出现痘疹为特征的高度接触性传染病。1997年，此病被国际兽疫局列为A类传染病。本病主要发生在非洲、欧洲和亚洲。从1985年至今，我国河北、福建、江苏、河南、山东、贵州、广西等省区均有山羊痘发生和流行的报道。近年国内山羊痘的发生与流行呈上升趋势，给我国养羊业造成巨大的经济损失。

目前，山羊痘的诊断主要依靠临床经验来判断，确诊还需实验室确定。目前报道的实验方法有AGP、IHI、CIE、FAT和PCR等。为建立一种更敏感的血清学试验方法来检测山羊痘病毒抗原，本研究以兔抗山羊痘病毒IgG致敏绵羊红细胞为材料，采用反向间接血凝试验（RPHA）检测山羊痘病毒抗原。

1 材料与方法

1.1 毒株

山羊痘病毒株（GTPV-S-1），由甘肃省畜牧兽医研究所引进并保存。山羊痘活疫苗购自中牧集团兰州生物药厂。

1.2 细胞

Vero-E6传代细胞由甘肃省畜牧兽医研究所保存。绵羊睾丸细胞由本课题组制作。

1.3 方法

1.3.1 山羊痘病毒的增殖

取山羊痘病毒（GTPV-S-1）株在Vero-E6细胞上连续传代3代，出现细胞病变时收集细胞培养液；再在绵羊睾丸原代细胞上增殖，当细胞病变达75%上收集细胞培养液；同时设正常细胞作对照。

1.3.2 山羊痘抗原的制备

取山羊痘病毒（GTPV-S-1）在绵羊睾丸细胞上培养液40ml，反复冻融3次，4℃6000r/min离心30min，去除细胞碎片，收集上清液。在上清液中加入饱和硫酸铵使之达到50%浓度，4℃静置过夜。次日，4℃6000r/min离心30min，弃上清，取沉淀以适量0.01mol/L pH7.2 PBS 悬浮，并将悬浮液通过Sephadex G-200柱层析，以0.01mol/L pH7.2 PBS进行洗脱，收集洗脱液，用722型紫外可见分光光度计测其OD260和OD280，计算其病毒蛋白含量，为纯化的山羊痘病毒。依试验需要进行不同浓度的浓缩，作为山羊痘抗原。

1.3.3 兔抗山羊痘病毒血清与IgG制备

用山羊痘活疫苗皮下免疫注射健康家兔，30头份/只；7d后皮下免疫注射山羊痘活疫苗，30头份/只；14d后皮下免疫注射山羊痘活疫苗，40头份/只；21d耳静脉注射山羊痘病毒（GTPV-S-1）培养液2ml，间隔10d后采集全血分离血清，作为兔抗山羊痘阳性血清。

取山羊痘血清20mL用饱和硫酸铵盐析，提取IgG，并通过Sephadex G-25层析，测定洗脱液的OD280和OD260值，计算IgG含量，进行适量浓缩后作为兔抗山羊痘病毒IgG。

1.3.4 红细胞的醛化、鞣化与致敏

采集健康绵羊全血（加肝素抗凝），用0.01mol/L pH7.2 PBS洗涤3次，配成2.5%的红细胞悬液；取2.5%的红细胞悬液9份与1%戊二醛1份混合，室温下孵育90min，洗涤3次，制成2.5%的醛化红细胞，加入等量10-5的优质鞣酸溶液充分混匀，37℃水浴作用15min，洗涤2次，用PBS配制成2.5%的鞣酸化醛化红细胞悬液，4℃保存备用。

将2.5%的鞣酸化醛化红细胞悬液2000r/min离心5min，取沉淀悬浮于10倍体积的0.1mol/LpH3.5醋酸盐缓冲液中，加入等体积的纯化兔抗山羊痘病毒IgG，37℃水浴感作2h，期间每隔15min轻轻吹吸混匀。用PBS洗涤5次，配成0.5%的悬液，作为兔抗山羊痘病毒IgG致敏红细胞，4℃保存备用。

1.3.5 RPHA实验方法的建立

取山羊痘抗原与PBS，在96孔U型血凝板上进行微量法反向间接血凝试验。

1.3.5.1 最佳试验条件的筛选

取山羊痘抗原，在不同的兔抗山羊痘病毒IgG致敏红细胞浓度、缓冲液、感作温度和感作时间下，确定最佳实验条件。

1.3.5.2 特异性试验

分别取羊口疮病毒抗原、猪瘟病毒抗原和O型口蹄疫病毒抗原，按RPHA实验方法进行操作和判定。

1.3.5.3 对比试验

用感染山羊痘的皮肤黏膜痘疹经处理取上清液作为山羊痘待检样品；同时，将收集的山羊痘病毒在Vero-E6上3代细胞培养液和在绵羊睾丸细胞上2代细胞混合培养液；另设细胞培养液为空白对照。用RPHA法和AGP法进行检测。

2 结果与分析

2.1 山羊痘病毒的增殖

GTPV-S-1能够在Vero-E6细胞和绵羊睾丸原代细胞上增殖，且能引起典型的细胞病变。感染初期细胞变圆、收缩，聚集成簇；此后病变细胞形成拉网状，细胞间隙增大，局部病变逐步扩展、弥漫、融合，最后细胞成片脱落死亡。

2.2 山羊痘抗原

山羊痘细胞培养物经盐析处理，层析后收集的洗脱液，测定OD280，发现第一峰的洗脱液能与山羊痘阳性血清出现沉淀线，其余各个峰值的洗脱液则不出现沉淀线。第一峰洗脱液的病毒蛋白含量为4.3075mg/mL。

2.3 兔抗山羊痘病毒血清与IgG制备

兔抗山羊痘血清经AGP检测效价为1：8。

兔抗山羊痘血清经硫酸铵盐析，Sephadex G-25层析，测IgG洗脱液的OD值，经计算其蛋白含量为1.36mg/mL，其AGP效价为1：8。

2.4 RPHA实验方法的建立

2.4.1 RPHA法最佳工作条件

经测定，采用0.5% 致敏红细胞、PBS、37℃感作1h优于0.25%致敏红细胞、盐水、4℃或室温、感作时间45min或90min。

2.4.2 特异性试验

用兔抗山羊痘病毒IgG致敏红细胞，分别与山羊痘病毒抗原、羊口疮病毒抗原、猪瘟病毒抗原和O型口蹄疫病毒抗原，按RPHA实验方法进行操作。结果显示，兔抗山羊痘病毒IgG致敏红细胞只与山羊痘病毒抗原发生反应，与其他病毒抗原均不发生反应。说明本致敏红细胞具有特异性。

2.4.3 对比试验

对比试验结果如表1。

甘肃省科技支撑计划（1104NKCL097）

陈伯祥（1968—），男，研究员，主要从事动物传染病防治研究。