解毒通络保肾法对糖尿病肾病大鼠肾小球Notch胞内域表达的影响

朴松兰王倩涵李 蓓郑晶晶牟美佳刘美春姜茗宸

（1 长春中医药大学基础医学院，吉林 长春 130117；2 长春中医药大学 护理学院2011级，吉林 长春 130117）

解毒通络保肾法对糖尿病肾病大鼠肾小球Notch胞内域表达的影响

朴松兰1王倩涵2李 蓓2郑晶晶2牟美佳2刘美春2姜茗宸2

（1 长春中医药大学基础医学院，吉林 长春 130117；2 长春中医药大学 护理学院2011级，吉林 长春 130117）

糖尿病肾病；解毒通络保肾法；肾功能衰竭；实验研究

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）在临床上以持续性蛋白尿和进行性肾功能减退并最终进展至终末期肾功能衰竭为特征，是糖尿病最常见的慢性并发症之一。在我国，糖尿病的发病率逐年增加，目前约有4千万人面临糖尿病威胁，而在终末期肾功能衰竭的患者中，DN所占比例也正逐渐增高。DN不仅严重影响患者的生活质量，还常常危及患者生命，因此探讨DN发生发展机制、找到针对DN的有效治疗方法显得非常有意义。

近年来，随着对肾小球滤过屏障结构和功能改变的深入研究，证实足细胞损伤是糖尿病蛋白尿产生和肾小球硬化的关键因素，多数证据支持足细胞凋亡是糖尿病足细胞减少的主要原因，与Notch通路激活密切相关，而该通路在DN的发病、发展过程中起到重要作用［1］。目前对Notch通路的研究主要集中在肿瘤发病学和胚胎发育领域，对DN肾小球病变研究甚少。

解毒通络保肾法是我校国家名老中医南征教授在50多年来从事DN临床与中医理论研究基础上提出的消渴肾病之治法，有很好的疗效，尤其在改善蛋白尿方面效果显著［2-3］。蛋白尿与肾小球足细胞脱落（主要是凋亡）而致的滤过膜通透性升高有密切关系，解毒通络保肾法改善蛋白尿的作用可能与对足细胞保护作用有关，这种保护作用可能是通过对Notch通路的抑制来减少足细胞凋亡或脱落，为了验证这个假设，进行实验研究，具体如下：

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物：8周普通级雄性Wistar大鼠60只（体质量180～230 g），由吉林大学基础医学院实验动物室提供。实验期间大鼠自由摄食和饮水。

1.1.2主要试剂和药品：链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）购自美国Sigma公司，解毒通络保肾胶囊由长春中医大学附属医院制剂室提供。

1.2方法

1.2.1大鼠DN模型制备方法：适应性喂养7 d后，禁食、不禁水12 h，按体质量随机分为正常对照组10只、DN模型制作组50只。以单次、大剂量腹腔注射STZ方法制备DN模型（剂量为STZ 52 mg/kg体质量，临用前用0.1 M枸橼酸缓冲液溶解，溶液pH 4.2），正常对照组仅腹腔注射等体积枸橼酸缓冲液。注射STZ 72 h后，从尾静脉采血，检测空腹血糖，将血糖≥16.7 mmol/L、尿糖+++以上大鼠视为DN模型制备成功。

1.2.2实验动物分组及给药方法：将造模成功的36只DN大鼠，按体质量、血糖随机分为DN模型对照组、解毒通络保肾法组和苯那普利组（西药对照）。本实验具体分组情况及给药方法如下：正常对照组（10只）；DN模型对照组（12只）；解毒通络保肾法组（12只），每日以5 g/kg体质量剂量灌胃解毒通络保肾胶囊混悬液；苯那普利组（12只），每日以15 mg/kg体质量剂量灌胃苯那普利混悬液。正常对照组和DN模型组灌服等体积生理盐水，连续给药8周，每日上午1次。

1.3观察指标：药物干预8周末，处死动物，打开腹腔，快速取出肾脏，按冠状面切开，迅速浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，4 μm厚度切片，常温保存。

1.3.1HE染色观察肾脏组织结构：将切片脱蜡至水，常规HE染色、封片后光学显微镜下观察。

1.3.2免疫组化方法检测NICD肾脏表达，棕黄色染色区域为阳性：将切片脱蜡至水，SP免疫组化法染色，光镜下观察。

2　结 果

2.1肾脏HE染色观察结果：正常对照组大鼠肾小球均无明显异常，绝大部分毛细血管袢开放，血管壁正常，系膜区细胞外基质（extracellular matrix，ECM）未见明显增多，近曲小管结构正常。DN模型组大鼠肾小球内部分毛细血管受压而塌陷，系膜区ECM无明显增多，所见近端小管上皮细胞高度水肿。解毒通络保肾组和苯那普利组大部分毛细血管袢开放，系膜区ECM无明显增多，偶见近端小管上皮细胞水肿。

2.2肾脏NICD免疫组化染色观察结果：NICD免疫组化染色，棕黄色着色区域为阳性，细胞核表达为Notch通路活化标志。正常对照组肾小球内出现少量阳性表达，主要为胞质表达；部分肾小管上皮细胞胞质及细胞核内有棕黄色着色区域，但主要以胞质为主，细胞核表达极少。DN模型组大鼠肾小球内出现较多棕黄色着色区域，细胞核表达多见；肾小管上皮细胞核内阳性表达增多。与DN模型对照组比较，解毒通络保肾组肾小球内细胞核阳性表达较少，肾小管上皮细胞阳性表达主要以胞质为主。苯那普利组肾小球内细胞核阳性表达亦较少，与解毒通络保肾组表达无明显差别。

3　讨 论

Notch信号通路是一种相对保守的、广泛存在于细胞间的信号传导通路，该通路在细胞的增生和分化中起到了关键性的作用。Notch信号由受体与配体相互作用而激活，配体诱导Notch受体发生构象变化，先后在细胞外金属蛋白酶和γ-分泌酶（γ-secretase）的作用下释放出Notch胞内域NICD，NICD 是Notch信号的活化形式。NICD进入细胞核后，激活Notch通路下游基因Hes和Hey，从而影响细胞分化、增殖和凋亡。目前Notch信号通路在肾脏中的研究，已从肾脏的发育转到肾小球疾病，该通路可能在足细胞的凋亡过程中起到了关键性作用。足细胞损伤是肾小球疾病发展的重要因素，可引起严重的蛋白尿。Notch信号通路的激活可能是足细胞病理损伤的一个常见机制，受损伤足细胞的最终结局依赖于Notch信号通路激活水平。足细胞数量减少会造成滤过膜对蛋白选择通透性的丧失，发生蛋白尿，而尿蛋白的增加将诱导肾小球纤维化和肾小管萎缩。在健康的成人肾脏肾小球内几乎检测不到Notch活化，NICD细胞核表达是该通路激活的标志。

解毒通络保肾法方药选榛花、大黄为君药，重在解毒、排毒；选黄连、双花（清热解毒，燥湿祛浊）和黄芪、丹参（益气通络，扶正抗毒）为臣药，共同起到增强君药的解毒作用；选生地、枸杞为佐药，取其养阴生津、滋补肝肾之用；地龙走窜入络为使药。诸药合用，共奏解毒通络、化瘀保肾之功效。本实验结果显示，解毒通络保肾法胶囊能够改善DN大鼠肾小球和肾小管结构，减少肾小球内细胞核NICD表达。该结果提示，解毒通络保肾法能够抑制糖尿病肾病大鼠肾小球内Notch通路激活，更具体作用机制有待于进一步研究、探索。

［1］Niranjan T，Bielesz B，Gruenwald A，et al.The Notch pathway in podocytes plays a role in the development of glomerular disease［J］.Nat Med，2008，14（3）：290-298.

［2］何泽，朴春丽，陈曦，等.解毒通络保肾法治疗35例糖尿病肾病临床研究［J］.中国实用中医药，2011，6（6）：165-167.

［3］何泽.解毒通络保肾法治疗糖尿病肾病验案［J］.中国中医药现代远程教育，2010，8（9）：65.

R587.2

B

1671-8194（2015）28-0040-02

项目受吉林省中医药管理局资助（2012-042）