荧光聚合酶链反应定量检测丙型肝炎患者血清中的HCV RNA及其意义

郝冬翠

（吉林省吉林市传染病医院，吉林 吉林 132002）

荧光聚合酶链反应定量检测丙型肝炎患者血清中的HCV RNA及其意义

郝冬翠

（吉林省吉林市传染病医院，吉林 吉林 132002）

目的 探讨定量检测丙型肝炎患者血清中HCV RNA与急、慢性病毒性肝炎和肝纤维化等疾病之间的关系，分析其与血清丙氨酸转氨酶（ALT）水平之间的关系。方法 在本组试验中，主要采用荧光聚合酶链反应（PCR）方法，以我院收治的103例不同临床类型的丙型肝炎患者为研究对象，对其血清中的HCV RNA进行定量检验。结果 无症状HCV感染者血清HCV RNA含量显著低于急性丙型肝炎、慢性丙型肝炎、肝硬化患者，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 血液中HCV RNA的检测已成为HCV感染诊断，是丙型肝炎患者病毒药物治疗疗效监测及血液筛查的重要手段。在肝损害和肝脏疾病进展过程中，高水平HCV RNA发挥着重要的作用。

荧光聚合酶链反应；定量检测；丙型肝炎；血清；HCV RNA；意义

全球慢性丙型肝炎病毒感染者1.7～2.0亿，其中我国的感染者已超过0.4亿，人群感染率约为3.2%。由此可见慢性丙型病毒性肝炎已成为我国严重的社会和公共卫生问题[1]。本组实验对丙型肝炎患者血清中HCV RNA含量与疾病程度、血清丙氨酸转氨酶（ALT）水平之间的关系进行研究，现进行如下报道。

1　资料与方法

1.1临床资料：选取2013年1月至2014年6月，在我院接诊103例丙型肝炎患者作为主要研究对象，通过对患者进行调查和了解，男性患者63例，女性患者40例，年龄在20～65岁，平均年龄为（43.41±1.65）岁。其中62例患者有输血史，根据全国肝炎会议制定的临床诊断标准，没有症状的丙型肝炎病毒（HCV）感染患者11例，急性肝炎23例，慢性肝炎58例，肝硬化巧11例。以上的病例中甲型肝炎、戊型肝炎病毒、乙型肝炎标志均未阴性，进行常规收集血清标本，将其置于-20 ℃的位置，对其进行统一检测。在进行血清采集之前，103例病例均未接受干扰素等抗病毒的治疗。

1.2方法：荧光PCR检测HCV-RNA的主要原理是通过荧光能量进行传递，并在此基础上，对两条互补配对的核昔酸的双链结构进行检验。通过对设计的双链信号引物的互补链进行研究，两条互补的链分别标记着荧光受体和供体，此信号的引物处于两条互补双链的结构之中，在此基础上，荧光能量起着传递的作用，并在荧光的受体和供体之间传递，从而会形成相应的荧光。PCR将会重复循环进行，随着变化信号引物的双链互补结构将被分开，其中一条链会参与产物的合成，并成为产物合成的一部分，同时荧光会随着双链互补结构的分开而消失[2]。在整体过程中，荧光的强度会发生相应的变化，随着我荧光强度的逐渐变化，其变化情况与反应中特异性扩增产物的量成比例关系。同时可根据纯化HCV-RNA建立标准曲线，通过计算机软件可计算出样品中HCV-RNA的含量[3]。

在本组实验进行检验过程中，主要采用美国（ABI）公司的7300荧光定量PCR检测系统。它是一种结合荧光探针的扩增检测技术，通过荧光信号的变化检测丙肝病毒RNA，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用对荧光信号积累的实时检测来监测整个PCR进程，最后通过校正曲线对未知模板进行定量分析。主要的试剂有HCV RNA阳性标准、荧光代R扩增引物、AMV逆转录酶、Taq-DNA聚合酶，HCV RNA阳性标准属于纯化的病毒RNA，将其置于-70 ℃保存。试验需要设立阳性、空白、阴性、峰值对照，计算每份标本两孔的均值。

1.3统计学分析：本次研究中，选择统计学软件SPSS15.0进行统计数据分析，其中计数资料以n/%形式表示，采用卡方（χ2）对计数资料进行检验，计量资料以（）形式表式，采用（t）对计量资料进行检验，如P＜0.05，则表示差异有统计学意义。

2　结 果

103例丙型肝炎患者血清HCV RNA含量范围在103～109拷贝/mL，无症状HCV感染者血清HCV RNA含量范围在105.1～101.8拷贝/mL，急性丙型肝炎患者血清HCV RNA含量范围在107.4～102.4拷贝/mL，慢性肝炎患者血清HCV RNA含量范围在107.6～102.5拷贝/mL，慢性丙型肝炎患者血清HCV RNA含量范围在107.8～103.0拷贝/mL。无症状HCV感染者血清HCV RNA含量显著低于急性丙型肝炎、慢性丙型肝炎、肝硬化患者。差异具有统计学意义（P＜0.05）。急性肝炎的HCV RNA水平低于慢性丙型肝炎，差异不明显无统计学意义。

3　讨 论

丙型肝炎病毒（HCV）主要指存在脂质外膜的单正链RNA病毒，其可引起肠道外感染，脂质外膜的单正链RNA病毒已经成为非甲非乙型肝炎的主要致病因子[4]。在通常情况下，丙型肝炎病毒中基因含量在血清中较低，一般常规的临床检测技术很难检验出来，当前通过应用自聚合酶链反应（PCR）技术方法进行检测，检测HCV RNA是显示HCV感染的一个可靠方法，也是HCV感染的最特异性检测，此方法为丙型肝炎病毒感染的诊断提供了有效的依据。

本组试验主要采用巢式扩增和双链引物，特异性得到明显的增高，在整个检验的过程中，需要再半封闭的环境下进行，同时不需要电泳分析，这样将在一定程度上减少了认为误差和交叉污染的机会。荧光PCR是具有较高的灵敏度、特异性的一项HCV RNA定量检测技术，同时模板提取及逆转录的效率直接提高了结果的准确性[5]。本组试验结果显示慢性丙型肝炎、急性丙型肝炎、肝硬化患者血清中的HCV RNA含量均高于无症状的丙型肝炎病毒（HCV）感染患者，表明在肝损害和肝脏疾病中，高水平的病毒复制可能发挥着重要的作用[6]，其中无症状的丙型肝炎病毒（HCV）所导致的肝细胞损害，在丙型肝炎发病机制中可能是很重要的一个方面。

[1]亓文骞.脾动脉栓塞对丙型肝炎肝硬化患者脾功能亢进的疗效及其在Peg-IFNα-2a抗病毒治疗中的应用价值探讨[D].长春：吉林大学，2010.

[2]吴大先，刘菲，刘洪波，等.转录介导扩增技术检测慢性丙型肝炎患者血清中HCVRNA及与RT-PCR的比较[J].中南大学学报（医学版)，2014，23（7)：664-672.

[3]范公忍，陈天宝，李冰，等.两种核酸提取方法对丙型肝炎病毒RNA检测效果的比较及应用评价[J].检验医学与临床，2015，11（1)：48-50.

[4]徐孝东.HCVF蛋白及HLA-DPA1/B1基因多态性与HCV感染慢性化和转归关系的研究[D].南京：南京医科大学，2014.

[5]吴大先，刘菲，刘洪波，等.转录介导扩增技术检测慢性丙型肝炎患者血清中HCVRNA及与RT-PCR的比较[J].中南大学学报（医学版)，2014，25（7)：664-672.

[6]张复春，唐小平，蔡晓莉，等.丙型肝炎病毒基因型与血清HCVRNA含量关系及其与干扰素应答的研究.中华微生物学和免疫学杂志，2012，18（3)：131-135.

R512.6+3

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1671-8194（2015）25-0118-02