生鲜牛乳中产Nisin菌株的筛选

□ 解晓静

一、引言

(一)天然防腐剂Nisin。

1．Nisin的作用机理。Nisin是由乳酸乳球菌乳酸亚种菌株产生的一种肽类细菌素，首次发现于1928年，Nisin与敏感菌细胞膜膜脂相互作用，通过结合、插入、孔道形成等多步过程形成孔道复合物，从而导致细胞内溶质(氨基酸、核酸、ATP等)的迅速流失、质子动力势的耗散，抑制细胞的生物合成(尤其是肽聚糖的合成)途径，直接或者通过对其他细胞毒素的敏化作用引起细胞的死亡。

2．Nisin的抑菌谱。Nisin的抑菌谱为G+菌;对于G—细菌没有作用，但膜干扰剂(EDTA、柠檬酸盐、磷酸钠等)或者亚致死伤害因素(加热、冷冻、超高压和脉冲电场等)会改变G—菌外膜对Nisin的通透性，使G—细菌变得敏感;此外，Nisin与一些天然成分和其他防腐剂组合使用时具有增益效应，从而改善其抗菌谱、增强抗菌效果。

(二)Nisin在食品防腐上的应用。

1．Nisin使用的安全性。对于Nisin，人们在食用乳制品时往往是无意摄入。由于Nisin是乳酸链球菌的天然产物，再加上迄今为止没有发现过中毒或者副作用的相关案例。所以很多人认为它是无毒的，虽然没有相关案例也并不能说明它的无毒，摄入量等方面都是其安全性的主要因素。研究发现乳酸链球菌素不会与其他抗菌素产生抗性，可以配合使用。在肠胃中，乳酸链球菌素能被蛋白质水解酶降解而迅速失活，食用含Nisin的液体10 min之后，在人体唾液中检测不出Nisin，不存在干涉肠道有益微生物的正常构成。目前对乳酸链球菌素已进行的毒性和生物学研究包括致癌性、肾功能、脑功能等，都证明乳酸链球菌素对人体无毒，因而被认为是安全的防腐剂。

2．Nisin在食品防腐应用上的广泛性。Nisin最早用于干酪的防腐，随后又成功应用于全脂消毒牛乳、灭菌乳、风味乳等各种乳制品的防腐保鲜。在肉制品中，其也有大量广泛的运用，最常见的如火腿、罐头等，不仅可以延长保存期，也可以改善食品外观，另外可以去掉或者降低亚硝酸盐的使用。

二、材料与方法

(一)试验材料。

1．菌种。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus):由微生物实验室提供。

2．主要培养基。富集乳酸菌培养基(脱脂乳培养基):将生牛乳煮沸10至20分钟，隔夜冷却，去掉上层脂肪。乳酸乳球菌试管斜面及发酵培养基(M17G培养基):蛋白胨1%，牛肉膏0．5%，酵母膏 0．25%，抗坏血酸 0．05%，硫酸镁 0．025%，甘油1%，磷酸二氢钾0．5%，乳糖0．3%，固体培养基中加入1．5%琼脂。分离培养基(M17培养基):蛋白胨1%，牛肉膏0．5%，酵母膏0．25%，抗坏血酸0．05%，硫酸镁0．025%，甘油1%，磷酸二氢钾0．5%，以蔗糖(1%)作碳源，同时含有0．004%溴甲酚紫。

(二)实验仪器。生化培养箱;高速离心机;高压蒸汽灭菌锅;电子天平;水浴锅等。

(三)主要试剂。包括蛋白胨，酵母膏，牛肉膏，抗坏血酸，MgSO4，KH2PO4，溴甲酚紫，蔗糖，乳糖，丙三醇等。

(四)实验方法。

1．乳酸链球菌的富集培养。取生牛乳5mL加入到100ml脱脂乳培养基中富集培养，28℃培养24h。按1%接种量吸取上述脱脂乳培养液1mL，加入到M17G液体培养基中，28℃培养24h。

2．指示菌悬液的制备。取金黄色葡萄球菌斜面一支，用接种针挑取少量菌种接种于营养肉汤液体培养基中，37℃发酵培养24h。得到的培养液作为原液，将原液稀释至10－1稀释度，备用。

3．乳酸链球菌素产生菌的筛选。把M17G液体培养物制成10－4、10－5、10－6稀释度的菌悬液，分别吸取0．1mL 放入M17分离培养基上，涂布，28℃培养24h，挑取单菌落，在分离培养基上划线，反复3次。

4．发酵液预处理。将划线得到的单菌落接种于M17G液体培养基中，28℃发酵培养24h。发酵液用2mol/L的HCl调整 pH 值至 2．5，然后在 90℃ 加热 30min，3，500r/min 离心20min，去除菌体收集上清液。

5．抑菌活性检测。于超净工作台上将配好的肉汤营养琼脂培养基倒入内径为90mm，高16mm～17mm的平皿内。适当增加培养基的厚度以备打孔。待凝固后倒入150μL指示菌悬液，涂布使其分布均匀。待菌悬液被吸收晾干后，用打孔器在营养琼脂培养基上打孔，直径为7mm，孔间距应足够大，以免抑菌圈重叠。注意打孔时不要将培养基打透。5min后向孔中滴加处理后的发酵上清液100μL，小心放入培养箱，28℃培养48h后观察抑菌圈直径大小。

三、结果与分析

(一)乳酸链球菌素产生菌的平板筛选。在蔗糖作碳源的M17培养基上，配以溴甲酚紫作指示剂进行乳酸链球菌素产生菌的平板筛选。如果一个菌株能在高浓度的蔗糖培养基上生长，表明该菌种具有较好的抗渗透作用，有可能是革兰氏阳性菌。如果该菌落周围的培养基由紫色转变为黄色，表明该菌落在代谢过程中分泌了酸性物质，从而改变了培养基的pH(见图1)。选择同时具备上述两个特征的菌落进行抑菌圈测定试验，分离到三株对金黄色葡萄球菌有明显抑制作用的菌株(见图2)。

图1 使M17培养基变黄的乳酸菌

图2 三株乳酸菌对金黄色葡萄球菌的抑制作用

(二)候选菌株显微镜观察鉴定。观察上述三株菌落，乳白色，隆起，外形光滑，湿润;在显微镜下观察，细胞球形，呈链状出现，革兰阳性，无芽孢，不运动。

四、结论

实验中得到了具有抗渗透且能分泌酸性物质的三株候选菌，抑菌圈试验证明其发酵液上清具有抗革兰氏阳性菌生物活性，经显微镜观察菌体形态与乳酸乳链球菌基本一致，故初步认定本实验筛选出三株产乳酸乳链球菌素的候选菌株。

五、创新之处

第一，从生鲜牛乳中分离乳酸乳链球菌，用脱脂乳培养基做富集培养。第二，以金黄色葡萄球菌做指示菌，观察抑菌效果。第三，参考文献中分离培养基中加入了50IU/mL过滤除菌的乳链菌肽。本实验中没有添加乳链菌肽。但是也分离得到了使M17培养基变黄的乳酸菌。显微镜下其菌落形态符合要求。

［1］孔健．天然食品防腐剂乳酸菌素——Nisin［J］．食品与发酵工业，1995

［2］还连栋，贾士芳，庄增辉等．乳链菌肽(Nisin)的杀菌作用机制［J］．中国食品添加剂，1997

［3］田文利，吴琼，吕红线等．乳酸链球菌素(Nisin)的研究进展［J］．食品工业，2000