开菲尔粒中优势乳酸菌的分离筛选与鉴定

□ 王 华 薛玉玲 冯丽莉 王世杰 朱 宏

开菲尔是以牛奶、羊奶为原料，用开菲尔粒作为发酵剂而制得的一种含醇、酸及少量二氧化碳的发酵乳，又称牛奶酒。开菲尔粒可用于家庭或工业化的开菲尔生产，它起源于俄罗斯北高加索地区，在古时当地的山岳牧民将牛乳或山羊乳注入羊皮口袋经自然发酵生产酸乳酒，其残留物再补加牛乳或山羊乳继续发酵，经长期发酵后在皮口袋中形成不规则颗粒状物体，即为开菲尔粒。开菲尔乳具有众多生理功能，Koroleva等研究认为开菲尔具有较高的营养价值和保健功效，可以抑制血压上升、预防心脏病、降低血清中胆固醇水平、预防胃肠道疾病等;Grag等认为一般酸奶中由于乳酸菌代谢消耗VB族，从而使酸奶中维生素含量下降，而开菲尔中VB含量明显提高。有人研究表明开菲尔中含有琥珀酸等四碳双羧酸，在机体内具有溶解癌细胞的作用;而最有价值的是开菲尔中含有0．2% ～0．7%的开菲尔多糖，这些多糖具有抗肿瘤、提高机体免疫等多种生物活性。然而，由于开菲尔本身所具有的特殊风味，不能很好地适应东方人的口味。因此，从开菲尔粒中筛选具有益生特性的乳酸菌具有非常重要的意义。

一、材料与方法

(一)实验材料。开菲尔粒:来源于波兰卡利什;培养基:含溴甲酚紫的MRS固体培养基;30%双氧水:天津市东方化工厂;糖发酵管:北京陆桥技术有限责任公司;DNA试剂盒及PCR试剂:天根生化科技有限公司。

(二)实验仪器。显微镜:奥斯巴林有限公司;生化培养箱:上海新苗医疗器械制造有限公司;电泳仪及电泳槽:北京六一仪器厂;超净台:上海新苗医疗器械制造有限公司;PCR仪:杭州博日科技有限公司;凝胶成像系统:北京六一仪器厂。

(三)试验方法。

1．乳酸菌的分离与纯化。将开菲尔粒在脱脂奶中活化3代后，取开菲尔粒1g，用灭菌生理盐水洗涤后，在灭菌的研钵中研磨成浆，加入9ml生理盐水进行稀释，取1ml稀释液进行适当稀释，将104、105、106稀释度涂布溴甲酚紫 －MRS琼脂平板。

取开菲尔粒发酵乳1ml，用生理盐水进行适当稀释，取106、107、108稀释度涂布溴甲酚紫－MRS琼脂平板。

上述平板置于37℃厌氧培养72h。取上述平板生长良好，具有典型菌落形态并出现颜色变化的菌落进行划线分离，在需氧条件下反复纯化3次。经革兰氏染色和接触酶反应，挑出革兰氏阳性、接触酶阴性的菌株进行保存备用。

2．乳酸菌的分离和鉴定。

(1)形态学鉴定。将分离纯化的菌株分别涂布到MRS平板培养基上，37℃培养48h～72h，取典型菌落进行革兰氏染色，显微镜下观察菌落形态。

(2)生理生化鉴定。将分离纯化的菌株分别进行葡萄糖产气试验，糖发酵管试验。

(3)分子生物学鉴定。将分离纯化的菌株进行DNA提取，16S rDNA PCR扩增，引物为:27F 5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG －3’，1492R5’－TACGGCTACCTTGTTACG ACTT－3’。PCR扩增片段为1500bp。反应后将样品进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，为阳性者送由华大基因进行测序，通过测序结果对筛选菌株进行分类。

二、结果与分析

表1 开菲尔粒中乳酸菌分离株的基本形态和特征

(一)菌株分离结果。从开菲尔粒中共分离得到一株乳酸杆菌和一株链球菌，并将其分别命名为KL22、KV30。通过染色镜检、过氧化氢酶试验、产酸产气试验，可以得知表1是从开菲尔粒中分离出的乳酸菌菌株的形态特征及部分理化特征。

(二)初筛结果。由于《可应用于食品的菌种名单》和《可用于保健食品的益生菌菌种名单》中大部分菌株均为杆菌，球菌只有嗜热链球菌一种，本次试验目的主要为筛选可食用的菌株，因此我们对上述杆菌进行了糖发酵试验，试验结果如表2所示。

表2 KL22菌株糖发酵结果

从表2中可以看出，通过糖发酵实验结果与《常见细菌系统鉴定手册》(科学出版社，2001年)中乳杆菌的鉴别特征进行对比，不能确定上述菌株的分子生物学分类，因此又对两株菌进行了分子生物学鉴定。

(三)乳酸菌分子生物学鉴定。我们对上述2株乳酸菌进行DNA提取及16S rDNA序列扩增，并对扩增片段进行电泳，从电泳图中我们可以看出目的片段大小正确，条带清晰，可用于后续的16S rDNA测序。

图1 菌株KL22的16S rDNA序列的系统发育树

图2 菌株KV30的16S rDNA序列的系统发育树

随后我们将上述2株疑似乳酸菌16S rDNA序列送至华大基因进行测序，并在 NCBI网站上利用 BLAST(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/BLAST)对所测菌株的 16S rDNA 序列与GenBank数据库中已知细菌的16S rDNA序列进行比较鉴定，寻找与目的基因序列同源性最高的已知分类地位的菌种，同时以非同属的模式菌株为外标，利用MEGA4软件绘制出系统发育树，由图1可知KL22与Lactobacilus kefiri strain NM180－3的亲缘关系最近，序列相似度为99%，因此将该菌株确定为开菲尔乳杆菌;由图2可知KV30与Streptococcus thermophilus亲缘关系最近，序列相似度为100%，因此将该菌株确定为嗜热链球菌。

三、结语

由于开菲尔粒中微生物分布的不均匀性，为尽可能多地分离其中的乳酸菌，本实验分别从开菲尔粒和开菲尔发酵液进行乳酸菌的筛选，并将开菲尔粒中筛选的乳酸菌命名为KL22，将开菲尔发酵液中筛选的乳酸菌命名为KV30。

通常开菲尔中乳杆菌包括开菲尔乳杆菌、明串珠菌、短乳杆菌、嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌等乳杆菌;不同来源的开菲尔粒，占优势的乳杆菌的种也不同。通过对本实验室中开菲尔粒中乳酸菌的筛选表明，其主要的优势乳杆菌为开菲尔乳杆菌。本次试验中只分离出了开菲尔乳杆菌和嗜热链球菌，未分离出其他菌株，其原因之一为初筛时菌种太多，分离现象不明显造成分离筛选过程中漏检个别菌株;原因之二可能为Rosi等人认为开菲尔中存在乳球菌、明串株菌以及醋酸菌和肠球菌是因为开菲尔生产过程中无菌条件差造成的。

因此，在以后菌株的分离筛选中应增加菌株分离筛选的明显性特征，并针对不同菌株采用不同的分离条件，以增加分离不同菌株的可能性。

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