从隔山消中制备4种苯乙酮对照品*

张锦，胡露，李月婷，刘俊宏，陈思颖，张桂青，李勇军

（1.贵阳医学院药学院，贵州贵阳550004；2.贵州省药物制剂重点实验室，贵州贵阳550004；3.民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州贵阳550004）

从隔山消中制备4种苯乙酮对照品*

张锦1，2，胡露1，3，李月婷1，2，刘俊宏1，3，陈思颖1，2，张桂青1，2，李勇军1，3

（1.贵阳医学院药学院，贵州贵阳550004；2.贵州省药物制剂重点实验室，贵州贵阳550004；3.民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州贵阳550004）

目的建立从隔山消中分离制备4种苯乙酮对照品的方法。方法采用溶剂提取，应用色谱技术分离纯化，根据化合物理化性质和光谱数据鉴定结构，用薄层色谱（TLC）法、高效液相色谱（HPLC）法进行纯度检查。结果制备得到的对照品经薄层色谱检查无杂质，纯度均在98%以上，符合中药化学对照品含量测定要求。结论制备所得的对照品可用于隔山消及其制剂的质量控制。

隔山消；苯乙酮；对照品

1　仪器与材料

超高效液相色谱仪（Acquity UPLC），质谱仪（Acquity-TQD），核磁共振波谱仪（JEOL-ECX-500）；柱层析用硅胶及硅胶G预制板（青岛海洋化工厂），Sephadex LH-20（瑞士Pharmacia Biotech公司），MCI75-150μm（日本三菱化学公司），D101大孔树脂（青岛海洋化工厂）。试剂均为分析纯，水为蒸馏水。隔山消药材由贵州飞云岭药业股份有限公司提供，经贵阳中医学院王世清教授鉴定为萝科植物耳叶牛皮消Cynanchum auriculatum Royle ex Wight的干燥块根。

2　方法与结果

2.1提取与分离

取隔山消药材粗粉15 kg，用70%乙醇回流提取3次，合并提取液，回收溶剂得稠膏，稠膏用水溶解成每1mL含1 g生药的溶液，静置，取上清液上于D101大孔树脂，依次用水、60%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱部分，减压回收溶剂至稠膏，取稠膏经硅胶柱层析以氯仿-甲醇（10∶0→7∶3，加少量醋酸）进行梯度洗脱，分段收集，各段进行薄层色谱（TLC）法检测并合并，得到7个部分。其中Fr.2经反复LH-20、硅胶柱层析得到化合物1（500 mg）、化合物2（200mg）、化合物3（300mg），Fr.3经反复的硅胶柱层析得到化合物4（9 g）。

2.2结构鉴定

化合物1：白色针晶（甲醇），紫外灯254 nm下有暗斑，碘反应阳性。ESI-MS（m/z）：136.6［M+H］+，134.6［M-H］-；1HNMR（500 MHz，CD3OD）δ：7.86（2H，d，J=8.55 Hz，H-2，6），6.82（2H，d，J=9.15 Hz，H-3，5），2.49（3H，s，COCH3）；13CNMR（125 MHz，CD3OD）δ：198.2（C=O），162.6（C-4），130.8（C-2，6），128.6（C-1），114.9（C-3，5），25.0（-CH3）。以上波谱数据及理化性质与文献［7］报道的4-羟基苯乙酮（4-hydroxyacetophenone）数据基本一致，故鉴定该化合物为4-羟基苯乙酮。

化合物2：黄绿色粉末，紫外灯254 nm下有暗斑，碘反应阳性。ESI-MS（m/z）：151.3［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，C5D5N）δ：7.55（1H，d，J=2.9 Hz，H-6），7.37（1H，dd，J=8.8 Hz，2.9 Hz，H-4），7.10（1H，d，J=8.8 Hz，H-3），2.49（3H，s，COCH3）。以上波谱数据及理化性质与文献［8］报道的2，5-二羟基苯乙酮（2，5-dihydroxyacetophenone）数据基本一致，故鉴定该化合物为2，5-二羟基苯乙酮。

化合物3：米白色粉末，紫外灯254 nm下有暗斑，碘反应阳性。ESI-MS（m/z）：153.1［M+H］+，151.2［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.71（1H，d，J=9.0 Hz，H-6），6.35（1H，dd，J=9.0 Hz，2.3Hz，H-5），6.23（1H，d，J=2.3 Hz，H-3），2.51（3H，s，COCH3）；13C-NMR（100MHz，CD3OD）δ：204.3（C=O），166.5（C-2），166.3（C-4），134.5（C-6），114.4（C-1），109.1（C-5），103.5（C-3），25.0（-CH3）。以上波谱数据及理化性质与文献［9］报道的2，4-二羟基苯乙酮（2，4-dihydroxyacetophenone）数据基本一致，故鉴定该化合物为2，4-二羟基苯乙酮。

化合物4：淡黄色晶体（氯仿-甲醇），紫外灯254 nm下有暗斑，氯化铁溶液显红棕色，碘反应阳性。ESI-MS m/z：303.2［M+H］+，301.4［M-H］-，603.4［2M-H］-；1H-NMR（500MHz，DMSO-d6）δ：2.21（3H，s，phenyl-CH3），2.54（3H，s，COCH3），6.44（1H，d，J=9.2 Hz，H-5），6.69（1H，d，J=9.2 Hz，H-3′），6.75（1H，d，J=9.2 Hz，H-4′），7.70（1H，d，J=9.2 Hz，H-4），8.51（1H，s，C5′-OH），9.31（1H，s，C6-OH），10.31（1H，s，C2′-OH），12.88（1H，s，C2-OH）；13C-NMR（125MHz，DMSO-d6）δ：203.2（C-7），203.1（C-8），162.5（C-2），162.3（C-6），148.0（C-5′），146.9（C-2′），132.2（C-4），130.2（C-6′），118.1（C-4′），117.4（C-3′），115.8（C-1′），112.3（C-3），111.5（C-1），107.5（C-5），30.7（C-10），26.2（C-9）。以上数据与文献［7］报道的白首乌二苯酮（baishouwubenzophenone）数据基本一致，故鉴定该化合物为白首乌二苯酮。

2.3纯度考察

2.3.1TLC法

4-羟基苯乙酮：将4-羟基苯乙酮样品用甲醇制成每1 g/L的溶液，分别点样2，5，10，15，20μL于硅胶GF254板上，分别以甲苯-乙酸乙酯-冰乙酸（7∶3∶0.05）、氯仿-丙酮-冰乙酸（9.5∶0.5∶0.05）、氯仿-乙酸乙酯-冰乙酸（8∶2∶0.05）为展开剂。紫外光灯254 nm波长下检视后用碘显色，在日光下检视。结果表明，在3种展开剂和2种检视方式下，样品均为1个斑点，未见其他杂质斑点。

2，5-二羟基苯乙酮：将2，5-二羟基苯乙酮样品用甲醇制成1 g/L的溶液，分别点样2，5，10，15，20μL于硅胶GF254板上，分别以甲苯-乙酸乙酯（8∶2）、氯仿-乙酸乙酯（9∶1）、石油醚-乙酸乙酯（7∶3）为展开剂。紫外光灯254 nm波长下检视后用碘显色，在日光下检视。结果表明，在3种展开剂和2种检视方式下，样品均为1个斑点，未见其他杂质斑点。

2，4-二羟基苯乙酮：将2，4-二羟基苯乙酮样品用甲醇制成1 g/L的溶液，分别点样2，5，10，15，20μL于硅胶GF254板上，分别以甲苯-乙酸乙酯（8∶2）、氯仿-乙酸乙酯（9∶1）、石油醚-乙酸乙酯（7∶3）为展开剂。紫外光灯254 nm波长下检视后用碘显色，在日光下检视。结果表明，在3种展开剂和2种检视方式下，样品均为1个斑点，未见其他杂质斑点。

白首乌二苯酮：将白首乌二苯酮样品用甲醇制成1 g/L的溶液，分别点样2，5，10，15，20μL于硅胶GF254板上，分别以氯仿-甲醇（9.2∶0.8）、氯仿-乙酸乙酯-甲醇（7∶3∶0.5）、氯仿-丙酮（7∶3）为展开剂。紫外光灯254 nm波长下检视后用碘显色，在日光下检视。结果表明，在3种展开剂和2种检视方式，下样品均为1个斑点，未见其他杂质斑点。2.3.2高效液相色谱（HPLC）法

4-羟基苯乙酮、2，5-二羟基苯乙酮、2，4-二羟基苯乙酮：称取3种样品适量，分别用甲醇制成质量浓度为1 g/L的溶液。色谱柱为AgilentEclipsePlusC18RRHD柱（100mm×2.1mm，1.8μm），流动相为0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱程序为0min（5∶95）～10min（100∶0），流速为0.3mL/min，柱温为40℃，检测波长为205，220，254，280，310nm，进样量为3μL。结果表明，在5个波长下所得HPLC图谱中显示1个主峰，采集时间为主峰保留时间的2倍以上。质量分数以峰面积归一化法计算均大于98%。

白首乌二苯酮：称取白首乌二苯酮适量，用甲醇制成质量浓度为1 g/L的对照品溶液。色谱柱为Diamonsil C18柱（250mm× 4.6mm，5μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱程序为0 min（15∶85）～40 min（80∶20），流速为1 mL/min，柱温为35℃，检测波长为205，220，254，280，310 nm，进样量为10μL。结果表明，在5个波长下所得HPLC图谱中显示1个主峰，采集时间为主峰保留时间的2倍以上。质量分数以峰面积归一化法计算均大于98%。

3　讨论

由于隔山消的主要成分C21甾体苷类多为去氧糖甲醚的糖苷，经试验研究，该类成分无法经水煎煮提取出来。为寻找隔山消药材水溶性部位质量控制指标成分，笔者对隔山消水溶性部位化学成分进行研究，对其中含量较高的4个化合物进行制备，结果表明，分离制备得到的4个化合物纯度均大于98%，并进行高温、高湿和强光照射试验，4个对照品理化性质均较稳定，达到了中药新药质量标准用化学对照品的要求，故可作为隔山消及其制剂的质量控制用对照品。

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Preparation of 4

ubstances of Acetophenone from Cynanchum Auriculatun

Zhang Jin1，2，Hu Lu1，3，Li Yueting1，2，Liu Junhong1，3，Chen Siying1，2，Zhang Guiqing1，2，Li Yongjun1，3
（1.School of Pharmacy，Guiyang Medical College，Guiyang，Guizhou，China 550004；2.Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics，Guiyang，
Guizhou，China 550004；3.Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM，Ministry of Education，
Guiyang，Guizhou，China 550004）

Objective To establish a method for the isolation and preparation of 4 reference substances of acetophenone from Cynanchum auriculatun.M ethods Chromatographic techniques were employed for isolation and purification of the constituents and their structures were determined by spectral analysis and chemical evidence.The purity was analyzed by TLC and HPLC.Results The purity levels of these compounds were all over 98%，which was in auordance with thd content determination requirement of the TCM chemical reference substance.Conclusion These compounds can be used as a reference substance in the quality control and the preparations of Cynanchum auriculatun.

Cynanchum auriculatun；acetophenone；reference substance

R284.1；R282.71

A

1006-4931（2015）16-0012-02

张锦（1991-），女，硕士研究生，主要从事中药、民族药的质量控制研究工作，（电子信箱）1208552141@qq.com；李勇军（1973-），男，教授，硕士研究生导师，主要从事天然药物化学、中药新药制备工艺及质量标准研究，本文通讯作者，（电子信箱）liyongjun026@126.com。

2015-02-05）

*国家科技支撑计划项目，项目编号：2013BAI11B01；贵州省科技厅资助项目，项目编号：［2013］4001，［2013］5062。