高渗盐水对重症脑出血的免疫调节作用研究

徐 玢 张初吉 李建国 于东明 郭 伟

首都医科大学附属北京天坛医院急诊科，北京100050

高渗盐水对重症脑出血的免疫调节作用研究

徐 玢 张初吉 李建国 于东明 郭 伟

首都医科大学附属北京天坛医院急诊科，北京100050

目的探讨10%高渗盐水对重症脑出血患者的外周血细胞计数及单核细胞亚群分布的影响。方法将首都医科大学附属北京天坛医院急诊科2012年4月～2013年4月收治的重症脑出血伴有中线移位患者共24例，随机分为高渗盐水治疗组（HS组）12例和甘露醇治疗组（MT组）12例。HS组给予10%氯化钠溶液50 mL静脉点滴，30 min输完；MT组给予20%甘露醇250 mL静脉点滴，15～20 min内输完。脱水治疗开始后0、1、3、6、24 h静脉采集外周血，进行全血细胞计数，及流式细胞仪测定血单核细胞CD16、CD14表达水平，两组患者血细胞计数值以均数±标准差（x依s）表示，组间比较使用两独立样本t检验，两组单核细胞亚群表达水平为频数资料，组间比较使用χ2检验。采用SPSS 13.0统计软件处理数据，以P＜0.05为差异有统计学意义。结果由于应激反应，两组患者基线的白细胞计数均增高，脱水后两组白细胞总数和中性粒细胞计数均有降低，6 h最为明显，差异有统计学意义（P＜0.05），24 h较前有所回升，但组间差异无统计学意义（P＞0.05）；与基线比较，脱水后MT组淋巴细胞计数降低，3、6 h最为明显，差异有统计学意义（P＜0.05），而HS组无明显淋巴细胞减少，组间3、6 h差异有统计学意义（P＜0.05）。脱水治疗后，外周血单核细胞亚群出现重新分布。MT组CD14++细胞显著下降，CD14++CD16+表达显著增加，而在HS组，CD14++细胞呈中度增加，CD14++CD16+亚群表达却显著减少，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论急性重症脑出血患者应用高渗盐水脱水治疗可促进淋巴细胞增殖，减少前炎症单核细胞CD14++CD16+亚群表达，减轻炎症反应，调节卒中后的免疫失衡。

脑出血曰高渗盐水曰免疫曰单核细胞亚群

脑出血因其高病死率及致残率已成为目前危及人类健康的严重疾病之一。脑出血的病情严重程度除了和病灶部位和血肿大小有关外，还和血肿局部的炎性反应、凋亡诱导、全身免疫抑制等密切相关[1-2]。研究显示，脑出血后继发性细胞及体液免疫失衡与出血后并发症发生及病死率直接相关[3-4]。因此，为了减轻脑功能缺损及减少并发症，研究如何维持脑出血后神经-免疫调节的平衡，也越来越受到关注。

目前对于脑出血患者进行免疫调节治疗的临床报道相对较少，仍处在试验阶段。而有研究显示，高渗盐水具有抑制白细胞活化、促进淋巴细胞增殖及抑制早期炎性反应等免疫调节作用[5-6]。因此，本研究探讨重症脑出血患者，应用高渗盐水脱水治疗后，外周血细胞计数及单核细胞亚群分布的变化。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取首都医科大学附属北京天坛医院急诊重症监护病房（EICU）2012年12月～2013年4月急性重症脑出血患者共24例，其中男15例，女9例；年龄28～70岁，平均（57.6±4.7）岁；格拉斯哥昏迷评分（GCS）3～8分。所有患者均经头颅CT扫描确认，其中出血量20～30 mL有11例，＞30 mL有13例，均伴有中线移位。诊断符合全国第四届脑血管病学术会议[7]修订的诊断标准。采用随机数字法，将所有患者分为高渗盐水治疗组（HS组）和甘露醇治疗组（MT组），各12例。HS组男9例，女3例；平均年龄（59.7±7.5）岁；其中底节区出血8例，脑叶出血2例，脑干及小脑出血2例；血肿体积（36.4±4.8）mL；GCS评分为（6.2±1.3）分。MT组男8例，女4例；平均年龄（60.1±6.9）岁；其中底节区出血9例，脑叶出血1例，脑干及小脑出血2例；血肿体积（35.8±5.3）mL；GCS评分为（5.9±1.1）分。两组性别、年龄、血肿位置、血肿大小、GCS评分等方面比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本临床研究方案经医院伦理学委员会批准，所有拟入选的研究对象，均知情同意并签署知情同意书。

1.2 入选及排除标准

入选标准：年龄大于18岁小于75岁发病24 h内的急性脑出血患者，头颅CT明确颅内出血20 mL以上，中线有移位，GCS评分3～8分。排除标准：①外伤、肿瘤、妊娠；②急性感染，以及最近3个月内有感染病史；③自身免疫性疾病；④血钠高于155 mmol/L，渗透压高于320 mOsm/L；⑤肾损害（肌酐水平＞601 μmol/L）；⑥心功能不全；⑦慢性肝病。

1.3 终止治疗的条件及处理

治疗过程中，若患者出现急性心功能不全或肾功能衰竭发生，立即终止本次治疗，并做相应处理。

1.4 抗体尧试剂和溶液

异硫氰酸荧光素（FITC）标记的单克隆抗体CD16、CD45，别藻青蛋白（APC）标记的CD14，藻红蛋白（PE）标记的阴性对照IgG，购自Gibco公司，多聚甲醛购自Sigma公司，流式细胞仪溶血素（fluorescence activated cell sorter lysing solution，FACS lysing solution）购自美国BD公司，流式细胞仪为美国BD FACS Calibur。10%高渗盐水及20%甘露醇由医院药房准备。

1.5 试验方法

HS组脱水治疗选用10%高渗盐水50 mL（脱水治疗频次每8小时1次10例/每6小时1次2例），MT组选用20%甘露醇250 mL脱水治疗（脱水治疗每8小时1次10例/每6小时1次2例），HS滴注时间为30 min，MT滴注时间15～20 min（均通过锁骨下深静脉输注）。其余遵照脑出血常规治疗。

1.6 血液收集

用处理有乙二胺四乙酸（EDTA）和肝素钠的玻璃真空管收集血标本，取脱水治疗后0、1、3、6、24 h全血两管各2 mL，一管送检全血计数，另一管检测单核细胞表面CD分子表达。

1.7 外周血单核细胞CD14尧CD16的测定

取2支流式管，各加入50 μL全血，在试管1中加入阴性对照同型IgG检测非特异性结合，在试管2中加入抗CD-45-FITC、CD-45-FITC和CD14-APC抗体各10 μL检测中性粒细胞和单核细胞亚群，轻轻混匀，室温下避光15 min，然后加入1.5 mL溶血剂，静置15 min，3000 r/min离心，洗涤后弃上清，用200μL磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffered saline，PBS）液重悬，流式细胞仪检测细胞表面CD分子表达。

1.8 流式细胞仪分析

先用CD45、CD14圈取单核细胞门，然后进一步设门鉴别共表达的CD16和CD14的2个主要的单核细胞亚群，即CD14++CD16-亚群和前炎症单核细胞亚群CD14++CD16+。

1.9 统计学方法

临床试验设计采用随机对照方法，应用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x依s）表示，两独立样本的计量资料采用t检验；重复测量的计量资料采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料采用精确概率法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

24例患者全部纳入试验，治疗过程中，未有患者出现急性心功能不全或肾功能衰竭发生终止试验，未有电解质紊乱、高渗透压等副作用需要干预治疗病例。

2.1 两组脱水前后白细胞尧中性粒细胞尧淋巴细胞计数比较

由于急性脑出血的应激反应，所有患者基线的白细胞计数均增高，白细胞分类中以中性粒细胞增多为著。HS组及MT组患者脱水后白细胞计数和中性粒细胞计数均有降低，6 h最为明显，与基线比较，差异有统计学意义（P＜0.05），24 h较前有所回升，两组比较，HS组白细胞计数低于MT组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；MT组患者脱水后淋巴细胞计数降低，3、6 h最为明显，与基线比较，差异有统计学意义（P＜0.05），24 h较前有所回升，HS组无明显淋巴细胞减少，3、6 h组间差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 两组脱水前后全血单核细胞计数及亚群分布

脱水治疗后，外周血中典型单核细胞亚群（CD14++CD16-）和前炎症单核细胞亚群（CD14++CD16+）出现重新分布。与基线比较，HS组和MT组中，大部分单核细胞的仍为典型的CD14++亚群，但MT组CD14++细胞显著下降，CD14++CD16+表达显著增加。而在HS组，CD14++细胞呈中度增加，CD14++CD16+亚群表达却显著减少。两组CD14++CD16+单核细胞亚群百分比比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

3 讨论

随着研究报道的不断增多，近年来脑卒中后的早期免疫过度及后继的免疫抑制越来越受到关注。研究显示，脑出血后患者细胞免疫功能下降，如CD3、CD4 T细胞比例明显下降，且与病情呈正相关[8]。同样，出血性卒中后存在体液免疫反应异常，脑出血患者脑脊液中IgG和补体C3水平升高，外周血中分泌细胞因子的白细胞数量增多，导致血液中细胞因子分泌增多[9-10]。卒中后患者还出现继发性红细胞免疫功能低下，如红细胞免疫黏附功能下降[11]。而脑出血后血肿周围脑组织的炎性反应更为剧烈，在血肿周围脑组织存在缺血、炎性反应、凋亡等继发性损伤。多种细胞因子白细胞介素（IL）-1、IL-6、IL-8、IL-10、肿瘤坏死因子（TNF）、黏附分子、单核细胞趋化蛋白和血小板源性生长因子等均参与了脑出血后早期血肿周围脑组织炎性反应过程[12]。

单核细胞是调节免疫过程中的一种重要细胞群，可直接杀伤病原体或肿瘤细胞，或通过递呈抗原引起机体免疫应答，从而清除“异己”。人的单核细胞表面都表达有脂多糖抗体CD14，依据是否表达CD16可将其分为经典型（CD14++CD16-）、中间型（CD14++CD16+）及非典型（CD14+CD16++）单核细胞[13]。经典型占外周血单核细胞总数的80%～90%，后两群均占外周血单核细胞总数的5%～10%。三群单核细胞分别代表不同的分化成熟阶段，经典型和非典型亚群是单核细胞分化发育的两极，分别处于相对低分化和高分化阶段，而中间型是连接两极的过渡地带，因此也称为炎症性单核细胞亚群，它的表型比例失衡与感染及免疫相关[13]。因此，本研究探讨高渗盐水是否对脑出血患者的单核细胞亚群有免疫调节作用。

高渗盐水开始应用于创伤后的液体复苏，近年来，作为创伤后颅内压增高时应用的渗透性脱水药物，已越来越受到大家的关注，对于其安全性及对血流动力学的影响已有许多的研究，在安全性、降颅压效果方面均优于传统药物甘露醇[14]。而同时，有报道显示，高渗盐水可减缓炎症发生及发展。体外实验结果显示，高渗盐水可抑制中性粒细胞的活化和黏附，刺激淋巴细胞增殖，抑制前炎症因子，刺激单核巨噬细胞产生抗炎因子，减少激素分泌[15-17]。目前关于高渗盐水的临床试验多针对创伤性休克病例，体内试验提示，高渗盐水可抑制炎症的发生发展，减少创伤后血管内皮的炎性损伤，尤其对肺组织损伤有保护作用[18]。因此，本研究探讨出血性卒中患者应用高渗盐水后的免疫变化。而作为对照组的脱水药物甘露醇，并无相关的免疫作用研究及报道。所以，本研究选取中重度的急性脑出血合并脑疝患者，给予MT或HS脱水治疗，观察两组的外周血细胞计数变化，以及单核细胞亚群的再分布。由于高渗盐水可抑制白细胞的活化，本研究观察脱水后患者白细胞计数变化。结果显示，MT组和HS组白细胞及中性粒细胞计数均较基线明显下降，可能为高渗状态使细胞萎缩，激活渗透压感受器并抑制其他通路传入对中性粒细胞的激活[18]。虽然HS组的白细胞计数少于MT组，但组间差异无统计学意义。另外，MT组患者脱水后淋巴细胞减少，而HS组的淋巴细胞无明显变化，组间差异有统计学意义（P＜0.05），这证实了高渗盐水可促进淋巴细胞的动员和增殖，与以往的研究结果相同[10-13]。本研究显示，脑出血后，外周血中典型单核细胞亚群（CD14++CD16-）和前炎症单核细胞亚群（CD14++CD16+）出现重新分布。MT组虽然大部分单核细胞的仍为典型的CD14++亚群，但CD14++细胞比例较前明显下降，前炎症细胞CD14++CD16+亚群表达显著增加。这可能是由于细胞膜表面炎症趋化因子受体表达上调，因此表现出更强的促炎活性，合成分泌TNF-α、IL-6的能力显著增强[19]，促进出血后炎症反应的发生发展。而在HS组，CD14++细胞呈中度增加，CD14++CD16+亚群表达却显著减少。比较两组CD14++CD16+亚群百分比，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果提示，脑出血后单核细胞CD14++CD16+亚群出现明显的增殖，而高渗盐水可选择性减少此前炎症细胞亚群的增殖，抑制出血后过度的炎性反应。

免疫应答和炎性反应参与了出血性脑卒中的病理、生理过程，随着神经-免疫-内分泌研究的深入，针对出血后免疫功能的变化进行抗炎和免疫调理治疗已引起普遍关注[20-21]。高渗盐水既能通过渗透性脱水减轻脑组织水肿，也可通过调节脑出血后免疫失衡，减轻炎性反应引起的脑水肿，可能成为促进出血后中枢神经系统功能恢复的一个新的切入点。

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Study on immunomodulatory effects of hypertonic saline for severe in-tracerebral hemorrhage

XU BinZHANG ChujiLI JianguoYU DongmingGUO Wei
Department of Emergency,Beijing Tiantan Hospital,Capital Medical University,Beijing100050,China

ObjectiveTo investigate the effect of 10%hypertonic saline(HS)on peripheral blood cells count and distribution of monocytes subpopulations of patients with severe intracerebral hemorrhage.MethodsTwenty-four patients with severe intracerebral hemorrhage and midline shift admitted to Department of Emergency,Beijing Tiantan Hospital,Capital Medical University from April 2012 to April 2013 were randomly divided into:HS group(n=12)and mannitol(MT)group(n=12).Patients in HS group received intravenous administration of 50 mL of 10%sodium chloride within 30 min;MT group received 250 mL of 20%mannitol within 15-20 min.Peripheral blood samples were collected before dehydration treatment,and at 1,3,6,24 h after dehydration treatment,then the samples were measured for blood cell count and monocytes subpopulations including CD16,CD14 were detected by flow cytometer.Data of blood cell count were expressed as mean±standard(x依s),the inter-group comparison was carried out by independent sample ttest.The level of monocytes subpopulations was frequency date,the inter-group comparison was carried out by χ2test. SPSS 13.0 software was used for statistical analysis,P＜0.05 was taken as a statistically significant difference.ResultsThe hemorrhage stroke induced a significant leukocytosis in all patients as evidenced by elevating baseline cell counts. After dehydration,the total leukocyte and neutrophil counts in the two groups were all decreased,especially at 6 h,the difference was statistically significant(P＜0.05),they rose again at 24 h,while there were no significant differences in cell counts between the two groups(P＞0.05).Compared with the baseline,the lymphocyte count of MT group after dehydration was reduced,especially at 3,6 h,the difference was statistically significant(P＜0.05),while HS group showed no significant reduction of lymphocyte count, therewerestatisticallysignificantdifferencesof lymphocyte count after dehydration for 3,6 h between the two groups(P＜0.05).After dehydration,peripheralblood monocyte subsets showed redistribution.Cells of CD14++in MT group was reduced and the expression of CD14++CD16+was increased,while in HS group,cells of CD14++was moderately increased,and the expression of CD14++CD16+was reduced,there were significant differences between the two groups(P＜0.05).ConclusionApplication of HS for dehydration treatment in patients with acute severe intracerebral hemorrhage can promote lymphopoiesis,inhibit the expression of“pro-inflammatory”CD14++CD16+subsets,reduce the inflammatory response and adjust the immune imbalance after stroke.

Intracerebral hemorrhage;Hypertonic sodium;Immunology;Monocytes subpopulation

R743.34

A

1673-7210（2015）04（b）-0088-05

2014-12-29本文编辑：张瑜杰）

徐玢（1972.8-），女，硕士研究生，副主任医师；研究方向：细胞生物。

郭伟（1972.7-），男，博士，副主任医师；研究方向：呼吸内科。