不同产地丹参中淀粉与有效成分含量的比较

刘思琦 刘春生 文 刚 李 耿 付骁睿 任晓磊 王学勇.北京中医药大学中药学院，北京 000；.贵阳德昌祥药业有限公司，贵州贵阳 55000；.中日友好医院 全国中西医结合心血管病中心，北京 0009

不同产地丹参中淀粉与有效成分含量的比较

刘思琦1刘春生1文 刚2李 耿3付骁睿1任晓磊1王学勇1
1.北京中医药大学中药学院，北京 100102；2.贵阳德昌祥药业有限公司，贵州贵阳 550001；3.中日友好医院 全国中西医结合心血管病中心，北京 100029

目的建立一种丹参淀粉含量检测方法，测定不同产地样品淀粉含量，分析淀粉与有效成分含量间的关系。方法采用高氯酸-蒽酮比色法测定丹参植物干燥根中淀粉含量，进行方法学考察，并测定山东、河南、四川3个产地20株丹参样品，同时采用超高效液相色谱（UPLC）方法对样品中8种有效成分进行测定，分析二者的相关性。结果建立了一种丹参植物干燥根淀粉含量测定方法。该方法在0～50 mg/L内具良好的线性关系，具有良好的精密度、重复性和加样回收率，RSD均小于3%，方法准确可靠；不同产地丹参样品中淀粉的含量与丹参酮类成分呈正相关趋势，与丹酚酸类成分呈负相关趋势。结论丹参根中淀粉的积累与有效成分的代谢密切相关。

丹参；淀粉含量；有效成分；初生代谢；次生代谢；高氯酸-蒽酮比色法

环境胁迫使药用植物生长降低而次生代谢增加，这说明环境对于植物体内初生代谢活动与次生代谢的积累之间存在某种内在联系[1-3]。有研究显示，甘草药材中的重要初生代谢产物淀粉的含量与有效成分甘草酸的含量呈现明显的负相关，也证实了初生代谢产物淀粉与次生代谢产物有效成分存在密切关系[4]。同时，也有研究表明，不同栽培类型的丹参样品生物量与有效成分间呈现负相关[5]。因此，本项研究选用不同产地的丹参作为实验样品，建立一种适用于根类药材的淀粉含量测定新方法——高氯酸-蒽酮比色法，对3个产地丹参样品的淀粉及有效成分含量进行了测定并分析二者的相关性，为丹参及其他药用植物的质量调控、代谢研究和中药栽培方法研究等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂

1.1.1.1 仪器

BP 110S型分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；SIGMA 3K-15型低温高速离心机（德国SIGMA有限公司）；SY-601型超级恒温水浴（天津欧诺仪器仪表有限公司）；WFZ UV-2100型紫外-可见分光光度仪[尤尼柯（上海）仪器有限公司]；超高效液相色谱（UPLC）Accuracy系统，包括二元超高压溶剂系统、自动进样恒温样本管理器、二极管阵列检测器、Empower 3色谱工作站（美国Waters公司）；NANO-pure Diamond Ro+纯水系统（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.1.1.2 试剂

乙腈为色谱纯（美国Fisher公司），其他试剂均为分析纯。无水乙醇（北京化工厂）；高氯酸（天津政成化学制品有限公司）；蒽酮（国药集团化学试剂有限公司）；浓硫酸（北京化工厂）；乙酸乙酯（国药集团化学试剂有限公司）；水溶性淀粉（BBI）；无水甲醇（国药集团化学试剂有限公司）；甲酸（北京化工厂）。2%蒽酮试剂：精密称取1 g蒽酮，加入50 mL乙酸乙酯，超声使全部溶解，4℃避光保存备用。

1.1.1.3 药品

丹酚酸B对照品（批号：111562-200504）购自中国食品药品检定研究院；丹参酮ⅡA对照品（批号：130602）、隐丹参酮对照品（批号：121013）均购自成都普菲德生物技术有限公司（质量分数均≥98%）；二氢丹参酮Ⅰ对照品（批号：13082317）、丹参酮Ⅰ对照品（批号：13050701）均购自成都曼思特生物科技有限公司（质量分数均≥98%）；迷迭香酸（批号：1189-060824）、丹酚酸A（批号：1073-060113）均购自中药固体制剂制造技术国家工程中心（质量分数均＞98%）；紫草酸（批号：20216-201107）购自南昌贝塔生物科技有限公司（质量分数＞98%）。

1.1.2 实验样本

将不同产地来源的丹参苗，经北京中医药大学王学勇副教授鉴定均为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge.，于2013年3月统一种植于贵州省兴仁县丹参种植基地，以消除外界环境差异对药材品质造成的影响。丹参药材于2013年11月采收，去掉泥沙和根茎，阴干，同一植株丹参根剪成1～2 cm的小段，混合均匀。一部分粉碎机粉碎，过60目筛，将筛下粉末与未筛下粉末分别称重，用于淀粉含量的测定和计算；剩余部分粉碎过50目筛，用于丹参有效成分含量的测定。将不同样本编号标记，保存备用。见表1。

1.2 实验方法

1.2.1 实验原理

采用高氯酸-蒽酮比色法测定样品中淀粉含量。80%乙醇溶液水浴去除样品中的可溶性糖，以9.2 mol/L的高氯酸溶液水解并提取残留物中的淀粉，再以浓硫酸作为强酸溶液，既可以将未水解完全的寡糖进一步水解，又使单糖脱水生成糠醛类化合物，与蒽酮试剂结合生成蓝绿色化合物，于吸收峰630 nm处显色，用紫外-可见分光光度计测定丹参中的淀粉含量。

1.2.2 供试品溶液的制备

精密称量0.05 g样品粉末于10 mL离心管中，加入80%乙醇溶液8 mL，80℃水浴30 min，10 000 r/min离心3 min，弃上清。此步骤重复3次，后2次分别水浴10 min。残留物加入6 mL 9.2 mol/L高氯酸，快速震荡摇匀，反应5 min，10 000 r/min离心3 min，上清转移入100 mL容量瓶，重复3次。用6 mL蒸馏水洗涤残渣2次，12 000 r/min离心3 min，清洗液移入容量瓶。蒸馏水定容，摇匀，即得。

1.2.3 样品测定

精密量取1 mL供试品溶液于20 mL具塞刻度试管中，蒸馏水补足至2 mL，空白对照试管中只加入2 mL蒸馏水。每只试管中加入0.5 mL 2%蒽酮试剂，并缓慢加入5 mL 98%的浓硫酸，迅速摇匀，于沸水浴中准确计时1 min显色，取出迅速置于冰水浴中冷却5 min，取出后室温放置5 min，于630 nm处测定吸光度值。

1.2.4 淀粉含量的计算

样品吸光度值重复测定3次，求出平均值，带入标准曲线求出显色溶液浓度c（mg/mL），样品粉碎后所得未筛下粗粉质量为M（g），过筛后细粉质量为m（g）。

样品中淀粉含量W（%）=（1/0.05×1000）×m×（1/m+ M）×c×2×100×100%。

1.2.5 方法学考察

1.2.5.1 高氯酸溶液用量的确定

精密称定0.1 g丹参样品，分别加入2、4、6 mL的高氯酸溶液提取2次、6 mL提取3次及6 mL提取4次，发现6 mL高氯酸溶液提取3次可以将0.1 g粉末中的淀粉提取完全，但吸光度超出测定范围。因此，考虑到部分样品淀粉含量可能会偏高，确定提取方法为称取0.05 g样品，6 mL高氯酸溶液提取3次以确保样品中淀粉提取完全。

1.2.5.2 标准曲线的绘制

精密称取0.05 g淀粉于小烧杯中，加入18 mL 9.2 mol/L高氯酸，完全溶解后转移到100 mL容量瓶中，蒸馏水冲洗，移入容量瓶，定容，即为标准品溶液，待用。分别量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL标准品溶液于20 mL试管中，用蒸馏水补充至2 mL，检测方法同“1.2.3”项下的样品测定方法。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y= 12.829X-0.0057，r=0.9996。结果表明，淀粉含量在0～50 mg/L内具良好的线性关系。

1.2.5.3 精密度试验

精密称取S9样品粉末0.05 g，按“1.2.2”项下方法制备成供试品溶液，显色后，在 630 nm处测定6次，计算吸光度的RSD值为0.19%，表明方法精密度良好。

1.2.5.4 重复性试验

精密称取S9样品6份，每份0.05 g，按“1.2.2”项下方法制备成供试品溶液。显色后，在630 nm处测定其吸光度值，算出样品中淀粉含量，分别为3.78%、3.86%、3.76%、3.87%、3.72%、3.78%，其RSD值为1.53%，表明此方法重复性良好。

1.2.5.5 加样回收率试验

精密称取S9样品0.05 g 7份，按“1.2.2”项下方法制备成供试品溶液。量取0.5 mL供试品溶液于20 mL试管中，并加入0.2 mL淀粉标准品溶液，蒸馏水补足至2 mL。将混合液进行显色并测定其吸光度，计算淀粉含量和加入标准品淀粉的回收率。结果显示平均回收率为104.37%，RSD值为2.31%，见表2。

1.2.6 丹参有效成分的含量测定

采用实验室前期建立的UPLC法对样品中的有效成分进行检测，供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、色谱条件以及方法学考察均参照文献[6]。主要测定迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA 8个成分。其中4种水溶性成分于280 nm检测，4种脂溶性成分于265 nm检测，采用外标一点法计算样品有效成分含量。

1.2.6.1 溶液的制备

1.2.6.1.1供试品溶液的制备 取过50目筛的丹参粉末，精密称取0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇溶液50 mL，称定质量，超声处理30 min（功率：200 W；频率：40 kHz），放置冷却至室温，用75%甲醇溶液补足减失量，摇匀，溶液过0.22 μm微孔滤膜，续滤液作为供试品溶液。

1.2.6.1.2对照品溶液的制备 精密称取对照品粉末，以甲醇溶解并将对照品溶液分别稀释至迷迭香酸0.0202mg/mL、紫草酸0.358 mg/mL、丹酚酸B 0.87mg/mL、丹酚酸A 0.05 mg/mL、二氢丹参酮 0.0109 mg/mL、丹参酮Ⅰ0.0532 mg/mL、隐丹参酮0.0256 mg/mL、丹参酮ⅡA 0.023 mg/mL。

1.2.6.2 色谱条件

色谱柱为 Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相为0.5%甲酸溶液（A）-乙腈（B）系统，色谱洗脱梯度（以B相比例表示）为0～1 min 4%，1～2.5 min 4%～13%，2.5～7.5 min 13%～22%，7.5～8.5 min 22%～48%，8.5～12 min 48%～60%，12～13 min 60%～90%，13～14 min，90%；流速0.4 mL/min；进样量2 μL；柱温35℃；样品管理器温度4℃。色谱图见图1。

2 结果

2.1 不同植株丹参药材淀粉含量测定结果

采用所建立的丹参淀粉含量检测方法，对20株样本检测结果显示，丹参药材淀粉含量为3.49%～7.28%，其中样本S10中的淀粉含量最低，仅为3.49%，S11淀粉含量最高，达7.28%，最高与最低含量相差2倍多。提示丹参不同植株间淀粉含量差异较大。见表3。

2.2 不同产地丹参药材淀粉含量分析

对不同产地丹参样本间淀粉含量数据进行统计分析，山东、河南和四川3个产地样品淀粉含量平均值分别为（5.27±1.35）%、（4.50±0.57）%和（6.35±0.41）%。可见河南产丹参淀粉含量最低，其次是山东，而四川产丹参中的淀粉含量最高，高达6.35%，从样品的性状观察也可看出四川产丹参的根部较为粗壮，这可能与四川产丹参地处长江以南，雨量充沛，有利于植物生长，促进丹参初生代谢产物积累有关。

UPLC分析结果显示，不同产地来源的丹参药材丹参酮类成分和酚酸类成分差异较大，并与淀粉含量分别成负、正相关趋势：淀粉含量为四川＞山东＞河南；丹参酮类成分含量为河南＞山东＞四川；丹酚酸类成分含量为四川＞山东＞河南。具体而言，河南产丹参中丹参酮类成分的含量最高，丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量分别为0.41、1.75、2.06 mg/g；四川产丹参中丹参酮类成分含量最低，上述三种成分的含量分别为0.22、1.39、1.76 mg/g，见表4。这种趋势正好与淀粉含量相反，河南产丹参淀粉含量最低（4.50%），四川产丹参淀粉含量最高（6.35%）。提示不同产地丹参中丹参酮类成分积累与初生代谢产物淀粉的含量呈负相关趋势。对于丹酚酸类成分而言，河南产丹参中丹参丹酚酸类成分含量最低，迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸A的含量分别为5.06、1.60、0.50 mg/g，四川产丹参药材中丹酚酸类成分含量最高，分别为6.88、2.65、0.60 mg/g，见表5。丹酚酸类成分的这种趋势正好与淀粉含量一致。提示不同产地丹参中丹酚酸类成分积累与初生代谢产物淀粉的含量呈正相关趋势。

3 讨论

相比于对药用植物有效成分的研究，初生代谢产物则少有人问津，对重要初生代谢产物淀粉含量测定方法也未见系统的研究。据国内外文献报道[7-13]，淀粉含量测定方法的研究多集中在农作物、粮食饲料、海洋微藻或淀粉含量丰富的药食同源植物等与人类生产生活密切相关的领域。而这类经济作物多含初生代谢产物，可达10%以上，多达80%～90%，而次生代谢产物含量偏少，与药用植物的成分构成相区别。因此，笔者认为建立一种适用于药用植物的淀粉测定方法可以更加准确地对中药材的初生代谢情况进行评价。

对于丹参淀粉测定方法的选择，本实验采用了植物淀粉含量测定的常用方法酸解-蒽酮比色法[14-16]，并根据环境条件和样品特点进行了改进。在此方法中采用9.2 mol/L高氯酸溶液水解植物组织中的淀粉为单糖并促进其溶解和提取，同时，蒽酮比色法中使用的浓硫酸也会将没有水解完全的低分子糖进一步水解。酸水解虽然不如酶解准确快速，但由于价格便宜，反应条件要求低仍被广泛应用。在方法确定过程中，考察了对可溶性糖的提取方法，从而确定了最佳的乙醇溶液的用量和提取时间。并且在高氯酸提取中，采用比较方便的离心的方法代替费时的过滤方法，并对提取次数和提取时间等进行了考察，从而得到最简单易行且准确的适用于根类中药材淀粉的含量测定方法。

结果表明，丹参淀粉含量与二萜醌类丹参酮成分和丹酚酸类成分的积累间或许存在非常有意义的联系。对3个产地20株丹参样品的淀粉及有效成分分析结果（表3～5）显示，3个不同产地丹参中的淀粉含量高低顺序为：四川＞山东＞河南；丹参中水溶性成分如迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸A及水溶性成分的总和等，含量高低顺序为四川＞山东＞河南，均与淀粉含量呈现正相关的趋势；而在脂溶性二萜醌类成分如丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量及脂溶性成分的总和等其含量高低顺序均为：河南＞山东＞四川，与淀粉含量呈现负相关趋势，这可能与萜类成分生物合成途径中起始步骤与初生代谢终产物的紧密联系有关；而对于丹酚酸类成分，除迷迭香酸，其他物质的合成途径仍未有比较明确的认识[17]。因此，这一规律还有待于通过增加实验样本量等手段进一步确证。

本研究建立了一种适用于根类药用植物的淀粉含量测定方法，在此基础上，探讨了丹参中的淀粉含量与次生代谢产物积累之间的相关性。本研究结果对于丹参质量控制、栽培方法、采收加工等问题具有指导意义。

[1]黄璐琦，郭兰萍.环境胁迫下次生代谢产物的积累及道地药材的形成[J].中国中药杂志，2007，32（4）：277-280.

[2]刘玉堂，赵宪争，杨迎霞，等.环境因子影响丹参次生代谢研究进展[J].北方园艺，2014，（21）：199-202.

2.1 各组大鼠的一般情况 非糖尿病ZT23亚组及非糖尿病ZT11亚组大鼠精神状态良好，反应敏捷，毛色白且光泽；糖尿病ZT23亚组及糖尿病ZT11亚组大鼠每周血糖≥16.7 mmol/L,同时出现多食、多尿、多饮、体重减轻等症状，精神萎靡，反应缓慢，毛发无光泽。

[3]袁肖寒，张彦东，高学军，等.土壤水分对麦蓝菜生物量及王不留行黄酮苷含量的影响[J].植物研究，2014，34（6）：835-839.

[4]刘春生，王学勇，刘仁权，等.甘草药材中淀粉含量和甘草酸含量的相关性研究[J].中国中药杂志，2009，34（21）：2831-2832.

[5]唐晓清，王康才，陈暄，等.丹参不同栽培类型的生物量与水溶性、脂溶性成分积累的相关性研究[J].中草药，2006，37（5）：753-758.

[6]李耿，孟繁蕴，杨洪军，等.UPLC法同时测定丹参中11种成分的含量[J].中国药房，2014，25（19）：1766-1768.

[7]Parviz F，Sadequr R，Wickneswari R.Genetic controls on starch amylose content in wheat and rice grains[J].Indian Academy Sci，2014，93（1）：279-292.

[8]Dagmar Šimková，Jaromír Lachman，Karel Hamouz，et al. Effect of cultivar，location and year on total starch，amylose，phosphorus content and starch grain size of high starch potato cultivars for food and industrial processing[J]. Food Chem，2013，141：3872-3880.

[9]代立刚，何煜，王浩，等.谷物中总淀粉含量的测定方法[J].中国食物与营养，2013，19（6）：38-42.

[10]吴远琴，黄娟，郑兴汶，等.23份莲资源直链淀粉和支链淀粉含量测定[J].长江蔬菜，2014，（6）：41-43.

[11]于鲁浩，杨俊慧，孟庆军，等.玉米粉中淀粉含量的快速测定方法[J].山东科学，2012，25（1）：19-23.

[12]马群.酒醅淀粉含量测定方法的优化[J].酿酒，2013，40（6）：87-90.

[13]周俊华，邹优敬，宁俊平，等.粗饲料淀粉含量测定方法的比较研究[J].广西畜牧兽医，2013，29（6）：323-325.

[14]Bruno F，Giuliano D，Ana PA，et al.Starch determination in Chlorella vulgaris-a comparison between acid and enzymatic methods[J].J Appl Phycol，2012，24：1203-1208.

[15]Robin R，Cathy LR，Steven KO，et al.Starch determination by perchloric acid vs enzymes：evaluating the accuracy and precision of six colorimetric methods[J].J Agric Food Chem，1991，39：2-11.

[16]郭冬生，彭小兰.蒽酮比色法和酶水解法两种淀粉测定方法的比较研究[J].湖南文理学院学报：自然科学版，2007，19（3）：34-48.

[17]侯学敏.丹参迷迭香酸合成途径关键酶基因的鉴定与分析[D].西安：陕西师范大学，2013.

Relatinship between starch and effective constituents of Salvia Miltiorrhiza Bunge.from different habitats

LIU Siqi1LIU Chunsheng1WEN Gang2LI Geng3FU Xiaorui1REN Xiaolei1WANG Xueyong1
1.College of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China;2.Guiyang Dechangxiang Pharmaceutical Corporation Limited,Guizhou Province,Guiyang 550001,China;3.China-Japan Friendship Hospital the National Center of Combination of Chinese Traditional and Western Medicine in Cardiovascular Disease,Beijing 100029,China

ObjectiveTo establish a method for determination of starch content in Salvia Miltiorrhiza(SM),detect starch contents of samples from different producing areas by the method and analyze the relationship between starch and effective constituents.Methods After a systematic study on methodology,a perchloric acid-anthranone colorimetric method was introduced to detect starch contents of 20 samples from Shandong,He＇nan and Sichuan.An ultra performance liquid chromatography (UPLC)method was used to detect effective constituents contents in samples.The relevance between them was researched.Results A determination method for starch content was established which had a good linearity(0-50 mg/L),excellent accuracy,repeatability and recovery (RSD＜3%).A negative correlation trend of starch contents was found with liposoluble constituents contents and a positive correlation trend was found with hydrosoluble constituents contents in SMs from different origins.Conclusion It reminds a close relationship between starch accumulation and effective constituents metabolism in SMs.

Salvia miltiorrhiza Bunge.;Starch contents;Effective constituent;Primary metabolism;Secondary metabolism;Perchloric acid-anthranone colorimetric method

R284.1

A

1673-7210（2015）03（c）-0125-05

2014-12-13本文编辑：卫 轲）

国家自然科学基金项目（编号81274011）。

刘思琦（1989-），女，天津人，北京中医药大学2012级中药生药学专业在读硕士研究生；研究方向：药用植物与分子生药学。

王学勇（1977-），男，北京中医药大学副教授，硕士生导师；研究方向：药用植物与分子生药学。