脑苷肌肽促进星形胶质细胞分泌GDNF保护AAPH诱导神经元损伤的实验研究

郭安臣，赵一龙，苏芳，李巍巍，王拥军，王群

卒中已成为我国主要的死亡原因之一，而缺血性卒中占卒中的60%～80%，具有高致残、高致死的特点[1]。除急性期溶栓外，神经保护剂对缺血性卒中患者的康复有重要的意义[2]。脑苷肌肽为复方制剂，是由健康家兔肌肉提取物和牛脑神经节苷脂提取物混合制成的无菌水溶液。主要组分为多肽、多种神经节苷脂、游离氨基酸、核酸等，是目前临床常用的神经保护药物。但有关脑苷肌肽保护作用的机制尚有待探讨。因此，进一步研究脑苷肌肽在缺血性卒中后的神经保护机制，对于了解缺血性卒中的神经保护及研发新的神经保护剂有重要的意义。

星形胶质细胞是脑内主要的细胞类型，数量超过神经元的5倍以上，对维持神经元的生理功能起到重要作用[3]。而星形胶质细胞可以减轻脑水肿、减少自由基损伤等作用对缺血性卒中有越来越多的意义[4]。近年来，有关星形胶质细胞的神经保护作用日益受到研究者的重视。本实验从研究脑苷肌肽对星形胶质细胞的影响入手，进一步探讨脑苷肌肽对神经元的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 实验用鼠为SPF级Sprague Dawley（SD）大鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。其中，孕16～18 d的SD大鼠（10只）用于神经元培养，生后24 h的SD乳鼠（10只）用于星形胶质细胞培养。

1.1.2 主要试剂及仪器 杜尔伯科极限必需培养基（Dulbecco minimum essential medium，DMEM）、Neurobasal培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶购Invitrogen公司。细胞培养板、细胞培养瓶及离心管购自Corning公司。鼠抗神经丝蛋白（neurofilament，NF）单克隆抗体、鼠抗胶质细胞源性神经营养因子（glial cellderived neurotrophic factor，GDNF）单克隆抗体、兔抗胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗体、2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐［2，2’-Azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH］、碘化丙啶（propidium iodide）等购自Sigma公司。Alexa Fluor 568标记的山羊抗兔抗体、 Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠抗体购自Molecular Probes公司。Western Blot相关试剂购自普利莱公司。CCK-8细胞活性试剂盒购自东仁公司。脑苷肌肽由吉林四环制药有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 原代神经元培养 用10%水合氯醛将16～18 d孕龄大鼠麻醉后，置于超净工作台内，无菌条件下分离出胚胎，转移到Neurobasal培养基中。取皮层，剔除脑膜、血管，用培养基洗涤2次，剪碎，吹打分散细胞，0.25%胰酶消化10 min，过滤去除所有组织块，将细胞混悬于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM培养基中，接种于24孔培养板中，第2天去除培养板中的培养基，更换为神经元培养基：含有2%B-27添加剂的Neurobasal培养基，之后隔天换液。7 d后用于实验。

1.2.2 原代星形胶质细胞培养 将出生24 h内的SD乳鼠低温麻醉后置于75%乙醇中浸泡消毒5 min，无菌条件下去除颅骨，取出脑组织，置于装有预冷DMEM的无菌玻璃皿中，清洗3次，在解剖镜下用显微镊剥离脑膜及血管，将组织碎块转入装有5 ml 0.25%胰蛋白酶液的离心管内，放入37℃水浴培养箱中消化30 min，加入完全培养基（10%FBS+DMEM+双抗）终止消化，用吸管吹打20～30次，形成细胞悬液。经70 μm孔径滤网过滤去除组织碎块，收取细胞悬液后，1500转/分离心5 min，去除上清液，重悬细胞后转移至培养瓶中，置于37℃的5%CO2培养箱中进行培养，2～3 d换液1次，培养7～9 d后使用。

1.2.3 免疫荧光染色 原代培养的神经元和星形胶质细胞经4%多聚甲醛固定30 min后，经磷酸缓冲液（phosphate buffer，PBS）冲洗后加入0.2%Triton-X-100增加细胞膜的通透性，用10%山羊血清封闭抗原位点，鼠抗NF单克隆抗体（1∶400）、兔抗GFAP多克隆抗体（1∶500）分别加入到培养的神经元和星形胶质细胞中。4℃孵育过夜。充分清洗后分别加入Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠抗体（1∶400），Alexa Fluor 568标记的山羊抗兔抗体（1∶400）室温孵育1 h。荧光显微镜下观察，采集图片。

1.2.4 AAPH模拟缺血性卒中诱导神经元和星形胶质细胞损伤 AAPH溶于DMEM中制备1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L和40 mmol/L的溶液，分别加入神经元和星形胶质细胞中，同时加入CCK-8溶液，作用4 h后，利用分光光度计测定495 nm波长的吸光度，从而分析细胞活力，观察AAPH对细胞活力的影响。对照组未加AAPH，其他培养条件与AAPH损伤组一致。

1.2.5 脑苷肌肽对AAPH诱导星形胶质细胞损伤的影响 原代培养星形胶质细胞，经传代纯化后，先用40 mmol/L AAPH诱导损伤4 h。更换新培养基并加入0.025 µg/ml、0.05 µg/ml和0.1 µg/ml的脑苷肌肽作用24 h，之后加入CCK-8检测细胞活力。对照组未加AAPH，其他培养条件与AAPH损伤组一致。

1.2.6 脑苷肌肽－星形胶质细胞条件培养基制备原代培养星形胶质细胞，先用40 mmol/L的AAPH诱导损伤4 h。更换培养基并加入0.1 µg/ml的脑苷肌肽，保护24 h，之后收集培养上清液，经0.22 µm孔径滤网过滤备用。

1.2.7 Western Blot 原代培养星形胶质细胞，先用40 mmol/L的AAPH诱导损伤4 h。更换培养基并加入0.025 µg/ml、0.05 µg/ml和0.1 µg/ml的脑苷肌肽，保护24 h。对照组未加AAPH，其他培养条件与AAPH损伤组一致。经裂解、破碎、离心后，用Bradford法进行蛋白定量，调整各样品蛋白终浓度为20 μg/ml。取20 μl样品进行电泳、转膜、5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，滴加相应的GDNF抗体，滴加相应二抗（1∶1000），室温孵育2 h。PBS清洗，加入增强化学发光液（enhanced chemiluminescence solution）反应1～5 min，观察蛋白表达情况，并用Image J进行蛋白定量。

1.3 统计与分析 采用SPSS 15.0进行统计分析，符合正态分布的数据以（s）表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05表示差异具有显著性。

2 结果

2.1 AAPH能够模拟卒中制备神经元和胶质细胞损伤模型 原代培养神经元和星形胶质细胞后经神经元和星形胶质细胞特异性的标志物染色鉴定，培养的细胞分别表达神经元特异性标志物NF和GFAP，表明培养的细胞分别为神经元和星形胶质细胞（图1A，图1B）。而给予不同浓度AAPH可对神经元和星形胶质细胞造成损伤，细胞活性随AAPH浓度的增加而下降（图1C，图1D）。其中40 mmol/L AAPH可以明显诱导神经元和星形胶质细胞的损伤。

2.2 脑苷肌肽能够减轻AAPH诱导的星形胶质细胞的损伤 基于40 mmol/L AAPH能够诱导星形胶质细胞损伤，在AAPH损伤4 h后，分别给予0.025 μg/ml、0.05 μg/ml、0.1 μg/ml、0.2 μg/ml的脑苷肌肽共同孵育24 h，检测星形胶质细胞活力。结果表明，不同浓度的脑苷肌肽均能够减轻AAPH造成的星形胶质细胞损伤，其中0.05 μg/ml和0.1 μg/ml的脑苷肌肽的保护作最为显著（图2）。而0.2 μg/ml的脑苷肌肽未表现出对星形胶质细胞的保护作用。

2.3 脑苷肌肽-星形胶质细胞条件培养基能够减轻AAPH对神经元的损伤 实验表明0.1 μg/ml的脑苷肌肽能够明显减轻AAPH诱导的星形胶质细胞的损伤作用。因此，本课题选用40 mmol/L AAPH诱导星形胶质细胞损伤，进而继续加入0.1 μg/ml的脑苷肌肽作用24 h后的细胞上清液作为条件培养基。在40 mmol/L AAPH诱导神经元损伤后加入脑苷肌肽-星形胶质细胞条件培养基作用24 h。检测神经元细胞活力。结果表明脑苷肌肽-星形胶质细胞条件培养基能够逆转AAPH造成的神经元损伤，结果具有统计学意义（图3）。

2.4 脑苷肌肽-星形胶质细胞条件培养基能够减轻AAPH诱导的神经元凋亡 PI是一种脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）染料，能够掺入到受损的DNA中，在荧光显微镜下观察，正常细胞不能着色，而损伤及死亡细胞产生红色荧光，可以作为一种检测细胞凋亡的指标。我们的实验表明，在给予脑苷肌肽-星形胶质细胞条件培养基作用24 h后，神经元凋亡的数量和AAPH损伤组相比明显减少（图4）。

图1 AAPH可以模拟缺血性卒中诱导神经元和星形胶质细胞损伤注：原代培养的神经元细胞体较小，突起分支少而较长，能够特异性表达神经元标志物NF（图1A）。原代培养的星形胶质细胞，突起分支多而较短，免疫荧光染色表明细胞能够特异性表达GFAP（图1B）。AAPH可以模拟脑缺血，10 mmol/L AAPH即可造成神经元的损伤，而对星形胶质细胞20 mmol/L AAPH才表现出损伤作用（“*”表明和对照组差异具有显著性）。AAPH：2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐；NF：抗神经丝蛋白；GFAP：抗胶质纤维酸性蛋白

图2 脑苷肌肽能够减轻AAPH诱导的星形胶质细胞损伤注：40 mmol/L AAPH能够造成明显的星形胶质细胞损伤，0.025 μg/ml、0.05 μg/ml、0.1 μg/ml的脑苷肌肽能够减轻细胞损伤，其中0.05 μg/ml、0.1 μg/ml脑苷肌肽的作用和对照组相比差异具有显著性（“*”表明P＜0.05）。而0.2 μg/ml的脑苷肌肽未表现出对星形胶质细胞的保护作用。AAPH：2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐

图3 脑苷肌肽－星形胶质细胞条件培养基能够减轻AAPH诱导的神经元损伤注：和对照组相比，40 mmol/L AAPH能够诱导神经元损伤，给予脑苷肌肽－星形胶质细胞条件培养基后，神经元损伤减轻，细胞活力明显恢复（“*”表明AAPH损伤和对照组相比细胞活力明显降低，差异具有显著性，P＜0.05。“**”表明脑苷肌肽－星形胶质细胞条件培养基能够减轻AAPH诱导的神经元损伤，差异具有显著性，P＜0.05）。AAPH：2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐

2.5 脑苷肌肽促进星形胶质细胞合成GDNF 原代培养星形胶质细胞经传代种于25 cm2培养瓶中，AAPH诱导损伤4 h后，分别给予0.025 μg/ml、0.05 μg/ml、0.1 μg/ml的脑苷肌肽共同孵育24 h，收取、裂解细胞蛋白，检测细胞中GDNF水平。Western Blot结果显示脑苷肌肽能促进星形胶质细胞合成GDNF，并呈明显的浓度依赖性。其中0.1 μg/ml脑苷肌肽组的GDNF水平明显高于AAPH损伤组、0.025 μg/ml脑苷肌肽组和0.05 μg/ml脑苷肌肽组，差异具有显著性（图5）。

3 讨论

缺血性卒中由于脑部血液供应障碍，能量耗竭造成大脑局限性脑组织的缺血性坏死或脑软化[5]。而缺血性卒中的治疗主要集中在溶栓和神经保护等方面[6-7]，治疗的重点是减轻神经元损伤、保护神经元功能。尽管以神经元为中心的神经保护研究取得了一定进展，但由于缺血性卒中病理生理机制极为复杂。同时细胞与细胞之间的相互联系、相互作用尚不明确，使得神经保护药物的研究受到极大影响[8]。

星形胶质细胞是中枢神经系统总数量最多的细胞类型，传统观点认为星形胶质细胞对神经元提供营养支持[9]。但近来研究发现，在损伤后成熟的星形胶质细胞可去分化为放射状胶质细胞使得脑损伤功能紊乱的神经系统连接得以恢复[10]。而溴化乙啶可以特异性与胶质细胞DNA和RNA结合，干扰其核酸与蛋白质合成，使得脑缺血模型中星形胶质细胞增生受抑制，梗死灶增大，可见星形胶质细胞可保护脑缺血后的神经元损伤[11]。这使得星形胶质细胞成为神经保护药物研发的新热点[12]。

AAPH是一种氧自由基生成剂，能够在细胞中生成自由基，进而模拟缺血性卒中后自由基对细胞损伤[13-14]。本实验结果表明，AAPH能够对神经元造成损伤，但4～6 h等短时间作用于星形胶质细胞能够增加星形胶质细胞的活性，表明和神经元相比，星形胶质细胞在缺血性脑损伤后对自由基损伤有更强的耐受性，而同时给予脑苷肌肽后的培养基上清液能够减轻AAPH对神经元的损伤[15]。

图4 脑苷肌肽－星形胶质细胞条件培养基减轻AAPH诱导的神经元凋亡注：碘化丙啶可以标记损伤后凋亡的细胞，实验给予AAPH后，凋亡细胞明显增多，而给予脑苷肌肽－星形胶质细胞条件培养基后，凋亡细胞明显减少（“*”表明AAPH损伤和对照组相比凋亡细胞明显增多，差异具有显著性，P＜0.05。“**”表明脑苷肌肽－星形胶质细胞条件培养基能够减少细胞凋亡，差异具有显著性，P＜0.05）。注：AAPH：2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐

图5 脑苷肌肽促进星形胶质细胞合成GDNF注：脑苷肌肽能够促进星形胶质细胞合成GDNF，不同浓度的脑苷肌肽作用于星形胶质细胞24 h后，星形胶质细胞表达GDNF随着脑苷肌肽浓度的增加而增多。其中，0.05 μg/ml、0.1 μg/ml的脑苷肌肽作用组和对照相比差异具有显著性（P＜0.05）。GDNF：胶质细胞源性神经营养因子

脑苷肌肽具有神经保护作用。脑苷肌肽系由健康家兔肌肉提取物和牛脑神经节苷脂提取物混合制成的无菌水溶液。其主要组份为多肽、多种神经节苷脂、游离氨基酸、核酸等。既往研究表明，脑苷肌肽具有神经保护作用，能够通过消炎等机制保护神经元，临床应用同样表明，脑苷肌肽能够减轻缺血性卒中患者症状，改善功能，促进恢复[16]。本实验通过体外细胞培养，发现脑苷肌肽-星形胶质细胞条件培养基能够降低AAPH诱导的神经元凋亡，增加神经元细胞活性。表明脑苷肌肽具有神经保护作用。

脑苷肌肽的保护作用是通过促进星形胶质细胞合成分泌GDNF间接发挥作用。GDNF是由胶质细胞分泌的一种神经生长因子，对神经元有明显的保护作用[17]。动物实验表明，预先定位侧脑室注射GDNF，可有效对抗脑缺血后神经元的凋亡[18]。在永久性脑缺血模型中给予GDNF，同样可减小梗死灶，减轻脑水肿，抑制神经元凋亡[19]。本研究通过离体细胞培养发现脑苷肌肽不仅能够减轻AAPH诱导的星形胶质细胞损伤，同时脑苷肌肽作用于AAPH刺激的星形胶质细胞，可以增加星形胶质细胞合成GDNF，从而发挥保护神经元的作用。

脑苷肌肽具有神经保护作用，其发挥神经保护作用的一种可能机制是促进星形胶质细胞合成胶质细胞源性神经生长因子。同时实验表明星形胶质细胞是神经保护作用的一个靶点，通过保护星形胶质细胞能够达到保护神经元进而促进卒中患者康复的作用。

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【点睛】

本实验通过体外研究发现星形胶质细胞是卒中后神经保护的重要靶点，对神经保护新药的研发有重要的理论指导意义。