MiRNA与血小板活性的研究进展：一个新的评估抗血小板治疗效果的潜在生物标志物

林泽明，刘新通

当今心脑血管疾病已成为人类非自然死亡的首要因素。抗血小板药物被广泛地应用于心脑血管缺血性疾病的二级预防。尽管抗血小板治疗方案的有效性已被证实，但患者对抗血小板药物的反应性不尽相同，心脑血管意外在二级预防中的再发占有一定比例。因此，在抗血小板的药物治疗中，有效地评估并平衡血栓形成与出血的风险尤为重要。目前临床上实施的抗血小板治疗方案中亟需一个恰当的中间指标，以及时地指导治疗剂量和治疗时间的调整，使治疗效益最大化。

自1993年发现首个微RNA（microRNA，miRNA）[1]至今，关于miRNA与疾病关系的研究进行得如火如荼，为许多难治病的诊疗提供了新的方法。血小板活性在心脑血管疾病中起着十分重要的作用。若能进一步揭示miRNA与血小板活性的关系，相关疾病的防治定能得到长足的发展。

1 miRNA的概述

miRNA是一种普遍存在于生物体内高度保守的非编码小RNA分子（约22个核苷酸），以碱基互补配对的方式结合mRNA，参与调控mRNA及基因表达过程中的转录后调节，从而达到调控基因表达的目的。作用机制主要为：切割mRNA长链；缩短mRNA多聚腺苷尾以降低其稳定性；降低mRNA在核糖体内翻译蛋白的效率[2]。由此看出，miRNA在调控基因表达方面主要起抑制作用。近年，发现大量的miRNA，目前miRNA数据库（http：//mirbase.org）已收录了1881种人类miRNA。

miRNA是生物体进行正常生命活动的一个重要因素。miRNA的异常可导致疾病的发生；疾病的发生在一定程度上也体现在miRNA的异常表达上。首个被发现与miRNA相关的疾病是慢性淋巴细胞白血病[3]。随后，在许多疾病发生的过程中都找到了相应的特异性表达的miRNA[4-5]。目前，已逐渐揭开miRNA与许多疾病的关系，收录相关研究结果的数据库miR2Disease（http：//www.mir2disease.org）也得以建立。

2 MiRNA在血小板及血浆含量丰富且十分稳定

血小板是一种由骨髓巨核细胞生成的盘状的、无核的细胞碎片，它对维持血流稳定及调控血栓形成有着重要的作用[6-7]。尽管人类血小板中缺少DNA，却含有大量不同种类的miRNA[6]。Landry等[6]通过微阵列芯片等技术发现了大量的血小板miRNA（共219种）。随着miRNA检测技术（如深度测序法）的发展，更多的血小板miRNA逐渐为人们所知。Osman等[8]检测了281种血小板miRNA并列出了其中含量最丰富的20种（表1）。血小板激活时所释放到血浆的微粒中也包含了大量的miRNA[9]，其中miR-223尤为丰富[8]。

miRNA不仅种类和含量十分丰富，它们在血浆、血清中也十分稳定。Chen等[10]从不同人群提取血清样本，经过各种严苛的处理（包括煮沸、反复冷冻、室温长时间放置、强酸、强碱、RNase、DNase）后使用荧光定量聚合酶链反应检测miRNA，发现与未经处理的血清检测结果差异无显著性，且血浆miRNA在健康中国人种的个体差异性并不显著。

3 miRNA参与血小板的形成

miRNA在干细胞分化及骨髓各系细胞生成和成熟的过程中的重要性[11-12]，以及某些miRNA在血小板生成过程中的作用被逐渐被揭开。miR-155能结合并抑制与骨髓细胞分化相关的mRNAs从而阻碍造血干细胞分化[11]；miR-28能靶向结合促血小板生成素受体，其表达抑制CD34+细胞来源的巨核细胞的最终分化，且在骨髓增生疾病患者的血小板中过度表达[13]；miR-150表达上调能促使巨核-血红细胞前体细胞向巨核细胞系而非红细胞系方向分化[12]。有研究者认为，miR-146a同样与巨核细胞系祖细胞的形成有所关联，但具体作用仍存在争议[14]。表2列出部分miRNA与血小板生成的关系。在血细胞生成的过程中，大部分miRNA主要起抑制作用[11，13，15]，但仍有许多与血小板相关的miRNA的作用机制有待被进一步解析。

4 miRNA表达与血小板活性密切相关

miRNA参与调节血小板mRNAs、蛋白合成及激活，其表达与血小板活性有着密切的关系[6，17-18]。Gidlf等[19]通过RNA测序法，发现在急性心肌梗死患者与健康对照人群中表达具有显著差异性的9种miRNA。其中8种在病变后表达下调；当中miR-22、miR-185、miR-320b和miR-423-5p含量在血小板上层浮液中增加，但在血栓抽吸后减少，表明miRNA在血栓形成前后的表达有所差异。Osman等[8]则通过对比754种miRNA在血小板静息及激活（凝血酶刺激1 h后）时的含量，发现了miR-15a、miR-339-3p、miR-365、miR-495、miR-98和miR-361-3p在血小板不同状态下（激活与否）的含量差异具有显著性（P＜0.001）。其中miR-15a和miR-339-3p在血小板激活状态表达下调（分别降低2.5倍和1.4倍），其余4种则上调（miR-365：2倍；miR-495：1.9倍；miR-98：3倍；miR-361-3p：6.5倍）。该研究表明miRNA能反映血小板的激活状态。Nagalla等[18]将受试者根据其血小板对肾上腺素的反应性高低分成两组，发现74种miRNA在两组间的表达具有差异性；miR-200b：PRKAR2B、miR-495：KLHL5和miR-107：CLOCK之间的负相关性在随后的体外试验中被进一步得到确认。

表1 血小板中含量最丰富的20种miRNA（从高到低排序）[8]*

此外，许多不同miRNA与血小板激活路径相关。miRNA在调节P2Y12mRNA的表达上有着重要作用[6]；而miR-223可作为评估P2Y12受体抑制程度的潜在生物标志物[20]；血小板miR-96则在调节囊泡相关膜蛋白8（VAMP8）中具有重要作用[17]。Leonard等[21]发现miR-376c在巨核细胞系中具有调控翻译磷脂酰胆碱转移蛋白的mRNA的作用，且miR-376c在不同人种中的表达差异造成了黑色人种血小板通过PAR4受体路径激活的活性高于白色人种。

以上研究表明，许多miRNA在血小板激活前后的表达有着明显差异，部分miRNA特异性参与调控血小板激活路径的某个环节，论证了miRNA与血小板活性具有相关性。实验中被检测的血小板miRNA在种类及作用机制上不尽相同，提示这种相关性是体现在血小板激活的不同路径的各个进程中。

5 miRNA作为潜在的评估抗血小板药物效力的生物标志物

尽管现在已有一些方法被用来评估抗血小板治疗中血小板活性，尚无一种是被认为具有良好临床应用价值的金标准[22]。现今评估血小板活性的方法大部分是基于血小板激活的某一条路径提出的，如P2Y12路径或COX-1活性。然而血小板激活不是一个单一的过程，而是通过多通道（且其中许多是相互平行的）来实现的[23]。因此，一种能够良好评估抗血小板药物对血小板活性作用的方法必须尽可能地覆盖较多的血小板激活路径。

miRNA与血小板的生成、mRNAs调控、蛋白合成和激活的各个过程息息相关[6，17]。血小板miRNA是否有可能作为一种潜在的评估抗血小板治疗方案效果的生物标志物呢？Willeit等[24]对9名健康志愿者（男性，＜40岁）进行连续4周的抗血小板干预（wk0：空白；wk1：10 mg普拉格雷；wk2：10 mg普拉格雷+75 mg阿司匹林；wk3：10 mg普拉格雷+300 mg阿司匹林），以96孔板血小板凝集测定和血栓素A的形成（作为血栓素B的替代测量）来评估血小板功能，结果表明随着联用阿司匹林剂量的加大，血小板抑制现象更为明显。相应的，通过TaqMan custom plating service特制的方法在不同阶段（day0/7/14/21）测定92种miRNA的含量（使用U6做参照），其中8种miRNA发生显著变化，提示循环中的血小板miRNA能反映血小板激活的程度，血浆miRNA可在一定程度上评估抗血小板治疗的效果。Shi等[20]筛选了33例慢性冠状动脉粥样硬化性心脏病的患者［（60.91±7.73）岁，接受负荷剂量300 mg阿司匹林+300 mg氯吡格雷24 h或100 mg阿司匹林+75 mg氯吡格雷5 d］，根据其对氯吡格雷的反应，以血小板活性参数（通过血管扩张刺激磷蛋白磷酸化流式细胞术测定）分为正常反应组（血小板活性参数＜56.5%，n=17）和低反应组（血小板活性参数＞56.5%，n=16），并测定两组患者血清miR-223和miR-96含量。结果表明，双抗治疗方案中，血小板miR-223而非miR-96与血小板活性参数存在统计学相关性（Spearman r=-0.403，P=0.020），从而证明了人体内存在能反映对抗血小板药物治疗反应性的特异miRNA。

然而Christian Stratz等[25]在5名健康志愿者中，分5个不同阶段抽取血液样本（day0/1/3/9：空白；day10：口服单剂量阿司匹林500 mg 24 h后），随后对不同阶段样本中血小板含量最丰富的20种miRNA[8]进行分析，结果表明单剂量阿司匹林抗血小板并不影响血小板miRNA表达。与Willeit[24]和Shi等[20]的研究结果不同，他认为miRNA的表达与抗血小板治疗并无统计学相关性。但该实验存在一定不足，如样本量少和单剂量阿司匹林无法代表抗血小板治疗。

近年来，在miRNA与血小板活性关系的大量研究中找到许多特异表达的miRNA，并揭示了miRNA在血小板激活的各个进程中的作用机制，且miRNA可作为抗血小板治疗方案中评估血小板活性的潜在生物标志物的可能性。然而，将miRNA应用于临床样本评估抗血小板治疗方案效果的研究数据比较缺乏，且在miRNA对抗血小板药物的反应性方面仍未完全达至一致。

现况而言，需要更多的相关研究进一步补充临床样本中miRNA对抗血小板药物反应性的数据。此外，除了着重于抗血小板过程中miRNA与血小板活性的定性研究，如何定量地评估两者的关系并绘制具有临床应用价值的相关曲线显得尤为重要。

1 Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V, et al. The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J]. Cell,1993, 75:843-854.

2 Bartel DP. MicroRNAs:target recognition and regulatory functions[J]. Cell, 2009, 136:215-233.

3 Mraz M, Pospisilova S. MicroRNAs in chronic lymphocytic leukemia:From causality to associations and back[J]. Expert Rev Hematol, 2012, 5:579-581.

4 Sepramaniam S, Tan JR, Tan KS, et al. Circulating microRNAs as biomarkers of acute stroke[J]. Int J Mol Sci, 2014, 15:1418-1432.

5 Hulsmans M, Holvoet P. MicroRNA-containing microvesicles regulating inflammation in association with atherosclerotic disease[J]. Cardiovasc Res,2013, 100:7-18.

6 Landry P, Plante I, Ouellet DL, et al. Existence of a microRNA pathway in anucleate platelets[J]. Nat Struct Mol Biol, 2009, 16:961-966.

7 Michelson AD. How platelets work:platelet function and dysfunction[J]. J Thromb Thrombolysis, 2003, 16:7-12.

8 Osman A, Falker K. Characterization of human platelet microRNA by quantitative PCR coupled with an annotation network for predicted target genes[J].Platelets, 2011, 22:433-441.

9 Hunter MP, Ismail N, Zhang X, et al. Detection of microRNA expression in human peripheral blood microvesicles[J]. PLoS One, 2008, 3:e3694.

10 Chen X, Ba Y, Ma L, et al. Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases[J]. Cell Res,2008, 18:997-1006.

11 Georgantas RW 3rd, Hildreth R, Morisot S, et al.CD34+hematopoietic stem-progenitor cell microRNA expression and function:a circuit diagram of differentiation control[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2007, 104:2750-2755.

12 Lu J, Guo S, Ebert BL, et al. MicroRNA-mediated control of cell fate in megakaryocyte-erythrocyte progenitors[J]. Dev Cell, 2008, 14:843-853.

13 Girardot M, Pecquet C, Boukour S, et al. miR-28 is a thrombopoietin receptor targeting microRNA detected in a fraction of myeloproliferative neoplasm patient platelets[J]. Blood, 2010, 116:437-445.

14 Starczynowski DT, Kuchenbauer F, Argiropoulos B,et al. Identification of miR-145 and miR-146a as mediators of the 5q- syndrome phenotype[J]. Nat Med,2010, 16:49-58.

15 Garzon R, Pichiorri F, Palumbo T, et al. MicroRNA fingerprints during human megakaryocytopoiesis[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103:5078-5083.

16 Edelstein LC, McKenzie SE, Shaw C, et al. MicroRNAs in platelet production and activation[J]. J Thromb Haemost, 2013, 11:340-350.

17 Kondkar AA, Bray MS, Leal SM, et al. VAMP8/endobrevin is overexpressed in hyperreactive human platelets:suggested role for platelet microRNA[J]. J Thromb Haemost, 2010, 8:369-378.

18 Nagalla S, Shaw C, Kong X, et al. Platelet microRNA-mRNA coexpression profiles correlate with platelet reactivity[J]. Blood, 2011, 117:5189-5197.

19 Gidlöf O, van der Brug M, Ohman J, et al. Platelets activated during myocardial infarction release functional miRNA, which can be taken up by endothelial cells and regulate ICAM1 expression[J].Blood, 2013, 121:3908-3917, S1-S26.

20 Shi R, Ge L, Zhou X, et al. Decreased platelet miR-223 expression is associated with high onclopidogrel platelet reactivity[J]. Thromb Res, 2013,131:508-513.

21 Edelstein LC, Simon LM, Montoya RT, et al. Racial difference in human platelet PAR4 reactivity reflects expression of PCTP and miR-376c[J]. Nat Med,2013, 19:1609-1616.

22 Aradi D, Storey RF, Komócsi A, et al. Expert position paper on the role of platelet function testing in patients undergoing percutaneous coronary intervention[J]. Eur Heart J, 2014, 35:209-215.

23 Voora D1, Ginsburg GS, Akerblom A. Platelet RNA as a novel biomarker for the response to antiplatelet therapy[J]. Future Cardiol, 2014, 10:9-12.

24 Willeit P, Zampetaki A, Dudek K, et al. Circulating microRNAs as novel biomarkers for platelet activation[J]. Circ Res, 2013, 112:595-600.

25 Stratz C, Nührenberg TG, Binder H, et al. Microarray profiling exhibits remarkable intra-individual stability of human platelet micro-RNA[J]. Thromb Haemost, 2012, 107:634-641.

【点睛】

与现有评估抗血小板治疗效果的方法相比，微RNA具有潜在的更好的临床应用价值。